[发明专利]一种检测跨膜蛋白单克隆抗体亲和力的方法

摘要

本发明公开了一种检测跨膜蛋白单克隆抗体亲和力的方法，主要包括以下步骤：1)构建膜蛋白高表达的稳定细胞株，确保FACS实验中，阳性结合峰有最大的右移；2)荧光素标记抗体；3)饱和性结合实验；4)竞争性结合实验；5)数据处理。本发明可以有效测定跨膜蛋白单克隆抗体的亲和力，而且避免了使用放射性同位素，具有安全、灵敏度高、重复性好、检测结果稳定可靠等优点。

主权项

1.一种检测跨膜蛋白单克隆抗体亲和力的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)构建膜蛋白高表达的稳定细胞株；具体步骤为：接种CHO-DHFR-细胞至细胞培养板中，培养后转染带有hETAR基因的载体，获得CHO-DHFR-hETAR细胞，然后50nM至10μM MTX加压筛选，构建的稳定细胞株分别进行FACS检测，利用多克隆ETAR抗体鉴定加压后的细胞群体，筛选后的CHO-DHFR-hETAR细胞膜上hETAR有大量表达，最后经过亚克隆、鉴定获得hETAR高表达稳定细胞株；(2)荧光素标记抗体；具体步骤为：PBS稀释纯化后的抗体至2mg/ml得抗体液，取抗体液与荧光染料混匀，混合摩尔比例为：抗体：荧光染料＝1∶7.5，室温旋转孵育1h得荧光素标记抗体；(3)饱和性结合实验，获得表观结合常数KD；用含10mM EDTA的PBS收集上述CHO-DHFR-ETAR细胞和阴性对照CHO-DHFR细胞，离心后弃上清，用流式上样缓冲液重悬，分至V型96孔板，1×105个细胞/孔，加入不同浓度梯度荧光素标记抗体，每个浓度2复孔，冰上孵育1h，离心，弃上清，用流式上样缓冲液洗一次，再离心，最后用流式上样缓冲液重悬，上机检测，计算每孔染色细胞的平均荧光强度；表观结合常数KD获得方法如下：采用Prism5软件计算饱和性结合实验数据：在X列输入一系列荧光标记抗体浓度，在A列输入总结合对应的平均荧光强度值，在B列输入非特异性结合对应的平均荧光强度值，再选择结合-饱和性实验分析模式，选择单结合位点-总结合/非特异性结合分析模块进行拟合，得出表观结合常数KD；(4)竞争性结合实验，得出竞争实验中的半抑制浓度IC50值；其中，竞争性结合实验具体为：用含10mM EDTA的PBS收集CHO-DHFR-ETAR和阴性对照CHO-DHFR细胞，离心后弃上清，用流式上样缓冲液重悬，分至V型96孔板，1×105/孔；另一块96孔加样板中，加入不同浓度梯度的无荧光素标记抗体以及固定浓度的荧光素标记抗体，每个浓度2复孔，预先混匀，再一起加至V型96孔板中，冰上孵育1h，离心，弃上清，用流式上样缓冲液洗一次，再离心，最后用流式上样缓冲液重悬，上机检测，计算每孔染色细胞的平均荧光强度；半抑制浓度IC50值获得方法如下：采用Prism 5软件计算竞争性结合实验数据：在X列输入一系列无荧光素标记抗体浓度，在A列输入相应非标记抗体竞争标记抗体结合ETAR细胞的平均荧光强度值，再将X列的浓度值转换成Log值，然后选择结合-竞争实验分析模式，选择单结合位点-拟合LogIC50模块进行拟合，得出竞争性结合实验中的半抑制浓度IC50值；(5)数据处理：根据公式Ki＝IC50/(1+([L]/KD))计算出竞争性抗体的Ki值，计算出抗体的竞争性Ki值，采用竞争性亲和力常数Ki代表待测抗体与膜蛋白抗原之间的亲和力大小，其中[L]代表竞争性结合实验中固定的标记抗体的浓度。