[发明专利]基于牛痘拓扑异构酶I的零背景载体构建方法

摘要

本发明公开了一种基于牛痘拓扑异构酶I的零背景载体构建方法，包括以下步骤：在质粒上引入ccdB基因表达单元，得到合成质粒；使用DNA聚合酶，通过PCR以引物A作为上下游引物，合成质粒为模板，进行大量扩增，产生线性前载体；并将线性前载体用琼脂糖凝胶电泳分离，并切胶纯化；再加入T4DNA聚合酶和dATP，突出线性前载体5`端；再加入引物B、引物C和NaCl充分混合，并在牛痘拓扑异构酶I的切割与连接，即得到零背景载体。本发明中引物B和引物C通过碱基互补配对与5`端突出的线性前载体结合，在牛痘拓扑异构酶I的切割与连接能力的作用下能够实现零背景，避免T4DNA连接酶连接反应中发生的非目的连接，提高了线性载体与双链接头连接效率高，简化构建流程。

主权项

一种基于牛痘拓扑异构酶I的零背景载体构建方法，其特征在于，包括以下步骤：1)在质粒上引入ccdB基因表达单元，得到合成质粒；2)使用DNA聚合酶，通过PCR以引物A作为上下游引物，所述合成质粒为模板，进行大量扩增，产生线性前载体；并将所述线性前载体用琼脂糖凝胶电泳分离，并切胶纯化；3)将步骤2)得到的所述切胶纯化的线性前载体中加入T4DNA聚合酶和dATP，突出步骤2)得到的所述切胶纯化的线性前载体5`端；4)在步骤3)得到的产物中加入引物B、引物C和NaCl充分混合，并在牛痘拓扑异构酶I的切割与连接，即得到零背景载体；所述引物A中5`‑3`的核酸序列为AAGGGCGAGACGCGAA(SEQ ID:1)；所述引物B中5`‑3`的核酸序列为TTCGCGTGTCGCCCTTATTCCGATAGTG(SEQ ID:2)；所述引物C中5`‑3`的核酸序列为CAACACTATCGGAAT(SEQ ID:3)。