[发明专利]三色堇种子浸泡法直接导入外源基因的遗传转化方法

摘要

本发明属于三色堇分子育种领域，涉及三色堇种子浸泡法直接导入外源基因的遗传转化方法。采用已露白的三色堇种子为转化受体，经根癌农杆菌浸泡介导目的基因导入受体，利用卡那霉素对转化后的植株进行抗性筛选，通过载体上的启动子和目的基因设计特异引物进行PCR检测，同时通过表型观测筛选得到转基因植株。本发明解决了三色堇再生顽拗的局限性，避免了常规转化基于再生体系的组织培养等程序，直接通过种子浸泡法转化外源基因，为定向改良三色堇的性状提供了新方法；本发明转化三色堇的方法不经过再生培养阶段，简化了操作，降低了成本；转化周期短，露白种子浸泡后长出子叶即可移栽上盆，转化仅需15天左右。

主权项

一种三色堇种子浸泡法直接导入外源基因的遗传转化方法，其特征在于，采用已露白的三色堇种子作为转化的受体材料，经根癌农杆菌浸泡介导目的基因导入受体，利用卡那霉素作为选择剂对转化后的植株进行筛选，通过PCR检测及表型观测筛选得到转基因植株，所述的转化步骤如下所述：(1)构建含有目的基因的重组质粒并导入根癌农杆菌，其中：重组质粒含NPTⅡ基因，具备卡那霉素抗性，且目的基因由35S启动子驱动；(2)将三色堇种子，装入离心管，加入蒸馏水，将种子振荡至管底，将离心管于40℃水浴15min后自然冷却，黑暗下静置23h后弃管内蒸馏水，加入80mg/L赤霉素溶液，振荡后在黑下暗静置1h，将种子置于双层纱布中，用蒸馏水冲洗搓去种子表面胶质，将种子用双层无菌纱布包裹，置于10％双氧水中振荡消毒15min，用蒸馏水洗净后将种子平铺于铺有湿润双层纱布的培养皿中，室温下暗培养，每隔24h观察种子状态，添加适量蒸馏水保持湿润，得到露白的胚根长为2～4mm的三色堇种子；(3)将步骤(2)所得的三色堇种子，置于步骤(1)所得的OD600为0.4，卡那霉素浓度为100mg/L的根癌农杆菌菌液中浸泡1.5h进行侵染；将侵染过的种子用蒸馏水清洗4‑5次后放入培养皿中，在27±1℃黑暗条件下继续培养；(4)将步骤(3)中的黑暗培养的种子于子叶脱离种皮后置于光照强度为2000lx光下培养，至子叶变绿时移栽入花盆中，于4‑5片真叶后进行抗性筛选；(5)对步骤(4)中的幼苗喷施350mg/L的卡那霉素溶液进行抗性筛选，获得抗性苗；(6)通过载体上的35S启动子和目的基因设计特异引物，对步骤(5)中的抗性苗进行PCR检测，获得阳性植株；(7)对步骤(6)中的阳性植株进行表型观测，与野生型拟南芥植株进行比较，获得表型发生明显改变的转基因植株。