[发明专利]一种L‑天冬氨酸氧化酶包涵体纯化复性方法

摘要

本发明提供了一种L‑天冬氨酸氧化酶包涵体纯化复性方法，包括如下步骤包涵体沉淀的收集,包涵体沉淀的充分洗涤，变性蛋白使用镍柱纯化,并通过将纯化的变性蛋白使用缓冲液D稀释至蛋白浓度低于1mg/ml，置于透析缓冲液中保持透析温度为4℃，透析12小时以上，离心收集上清。最后将上清使用超滤管浓缩，再通过分子筛纯化分离单体蛋白和聚集蛋白，获得均一的天然活性蛋白。本发明解决了L‑天冬氨酸氧化酶复性的问题，使用方便快捷的方法进行L‑天冬氨酸氧化酶的包涵体纯化以及复性，通过包涵体的漂洗以及镍柱纯化获得纯度较高的变性蛋白，通过一步透析复性过程，逐渐去掉变性剂，蛋白折叠为有活性的蛋白分子，复性效率不低于10%。然后经过一步透析和分子筛纯化获得有活性的高纯度酶。

主权项

一种L‑天冬氨酸氧化酶包涵体纯化复性方法，其特征在于：包括如下步骤：S1、包涵体沉淀的收集，将L‑天冬氨酸氧化酶基因进行针对大肠杆菌密码子优化，通过全基因合成构建于大肠杆菌表达载体上，通过诱导表达，获得表达菌体；将表达菌体使用6000rpm离心15分钟收集菌体，使用缓冲液A洗涤并悬起，菌体高压破碎，离心收集包涵体沉淀获得包涵体沉淀；S2、包涵体沉淀的充分洗涤，对S1中的包涵体沉淀使用含有非离子型表面活性剂的缓冲液B漂洗两次，再使用不含有非离子型表面活性剂的缓冲液C漂洗两次，并使用含有6~8M变性剂的缓冲液C溶解蛋白；S3、变性蛋白使用镍柱纯化，首先使用缓冲液C洗脱非特异性结合的杂蛋白，最终使用缓冲液D洗脱目的蛋白；S4、将纯化的变性蛋白使用缓冲液D稀释至蛋白浓度低于1mg/ml，置于透析缓冲液中保持透析温度为4℃，透析12小时以上，离心收集上清。