[发明专利]一种GC‑MS检测新鲜烟叶中初生代谢物和次生代谢物的方法

摘要

本发明提供一种GC‑MS检测新鲜烟叶中初生代谢物和次生代谢物的方法，所述方法步骤如下快速采集新鲜烟叶并用液氮现场速冻，转移到干冰中低温运回实验室，采用冻干机低温冷冻干燥的方法除去水分，并用粉碎机对烟叶进行粉碎，过40目筛，用溶剂超声提取粉碎后的烟叶中初生次生代谢物，对提取液的上清液进行氮气吹干，然后对吹干的提取物进行肟化反应、硅烷衍生化反应，最后采用GC‑MS分析。其优点在于烟叶采集方法可以真实反映采集烟叶所在的生长发育时期、采集部位、品种和产地。烟叶提取和检测方法可以涵盖新鲜烟叶中初生、次生代谢物，如糖、氨基酸、有机酸、甾醇、生物碱、多酚等，具有高通量检测特性，同时选择离子监测方法可以准确定性定量新鲜烟叶中初生代谢物和次生代谢物199个（标准品验证135个）。

主权项

一种GC‑MS检测新鲜烟叶中初生代谢物和次生代谢物的方法，其特征在于：采用提取溶剂低温超声萃取并衍生，通过气相色谱‑质谱联用仪GC‑MS实现新鲜烟叶中初生代谢物糖、氨基酸、有机酸和次生代谢物甾醇、生物碱、多酚的检测，具体步骤如下：1）烟叶的采集、干燥和粉碎：采摘烟株指定部位烟叶，迅速用液氮迅速冷冻以保证代谢物不发生降解；其中，冻干机预冷到‑40℃，冷冻干燥72h以除去烟叶中水分，之后用粉碎机粉碎，过40目筛，放于‑80℃冰箱保存；2）称量10‑30mg粉碎后的烟叶置于离心管中，加入100μL的内标溶液，用1mL的异丙醇‑乙腈‑水萃取溶剂超声提取，超声萃取后4000r/min离心10min，取上清液并用氮吹仪吹干；3）向吹干的提取液中加入甲氧胺盐酸盐的吡啶溶液，涡旋振荡后在35‑40℃条件下进行肟化反应90‑120min；该反应可以对糖等代谢物的醛基进行肟化保护，减少其异构体，便于定量比较；4）向上述溶液中加入作为衍生化试剂的N‑甲基‑N‑三甲基硅烷三氟乙酰胺MSTFA，涡旋振荡后在35‑40℃下进行硅烷衍生化反应30‑60min；5）采用GC‑MS进行检测，色谱质谱条件如下：GC部分：色谱柱：DB‑5ms(30m×0.25mm×0.25μm)；载气：He；进样量：1μL；分流比：10:1；流速：1.0mL/min；程序升温：70℃（4min）升到300℃（5min），以5℃/min的速率，进样口温度300℃；MS部分：传输线和离子源的温度为300℃和230℃，EI电离，扫描频率5scan/s，溶剂延迟5min，全扫质量范围40‑600m/z，选择离子扫描共50个组。