[发明专利]一种基于萜类的烟草代谢组学中新鲜烟叶样品质量的判别方法

摘要

本发明提供了一种基于萜类的烟草代谢组学中新鲜烟叶样品质量的判别方法。该方法步骤如下：通过检测新鲜烟叶中植醇和角鲨烯含量，计算其比值，采用气相色谱串联质谱GC‑MS对代谢组学研究中的新鲜烟叶样品中植醇和角鲨烯进行绝对定量分析，为代谢组学合格样品的选择提供依据。本发明具有准确可靠，简单可行的特点，可为烟叶代谢特征分析及相关烟叶代谢组学研究提供借鉴。 1

主权项

1.一种基于萜类的烟草代谢组学中新鲜烟叶样品质量的判别方法，其特征在于：通过检测新鲜烟叶中植醇和角鲨烯含量，计算其比值，采用气相色谱串联质谱GC‑MS对代谢组学研究中的新鲜烟叶样品中植醇和角鲨烯进行绝对定量分析；具体判别方法如下：

a、称取10~25g的冻干研磨烟叶样品，加入作为提取溶剂的正己烷0.75~1.5 mL，室温下超声提取30min，离心，将上清液转移到样品瓶中，并用氮气吹干；提取后的残渣加入0.6~1.2mL由甲醇和氢氧化钾溶液按4:1的体积比组成的混合液，70℃下振荡提取30min，离心，将上清液转移到Eppendorf管中；加入0.5~1.0mL正己烷，进行萃取；涡旋6 s，离心1 min；之后转移到上述样品瓶中，并用氮气吹干；衍生化：加入50~100μL 20mg/mL甲氧胺盐酸盐‑吡啶溶液，40~60℃反应60~90分钟，再加入50~100 μL N‑甲基‑N‑(三甲基硅基)三氟乙酰胺溶液，在40~60℃条件下反应30~90分钟，进GC/MS分析，采用保留时间和选择离子（SIM）模式定性，检测萜类物质的含量；分析步骤如下：GC‑MS分析数据可定性新鲜烟叶中的植醇和角鲨烯，通过绘制标准曲线可对所测得的植醇和角鲨烯进行绝对定量，将植醇和角鲨烯含量的比值作为区分代谢组学合格样品及变质的不合格样品的标准，即待测样品中植醇和角鲨烯含量的比值在120以上的为合格样品，可用于代谢组学分析，植醇和角鲨烯含量的比值在120以下的为变质的不合格样品，不可用于代谢组学分析；

b、GC/MS分析方法的气相色谱参数：色谱柱：DB‑35MS，规格为：30 m×0.25 mm i.d.×0.25 μm d.f. ；程序升温：起始温度60℃（3 min），25℃/min的速度升至210℃，0.8℃/min的速度升至220℃，15℃/min的速度升至310℃（13min）；载气：氦气；柱流速：1.0 mL/min；进样口温度：250℃；进样量 2 µL，分流进样，分流比 10:1；

c、GC/MS分析方法的质谱参数：电离电压：70 ev；离子源温度：250 ℃；传输线温度：280 ℃；定量离子对如下：法尼醇（135>107），叶绿醇（123>87），氘代十八烷酸（IS）（376>136），α‑西柏三烯二醇（156>141），β‑西柏三烯二醇（156>141），角鲨烯（149>107），环氧化鲨烯（135>107），胆固醇（329>121），菜油甾醇（255>173），豆甾醇（255>173），谷甾醇（396>255），香树脂醇（218>203）。

2.根据权利要求1所述的判别方法，其特征在于：所述提取溶剂中添加有5~20μL 2mg/mL内标氘代十八烷酸。

3.根据权利要求1所述的判别方法，其特征在于：所述冻干研磨烟叶样品为由大田采摘的新鲜烟叶样品置于‑196℃液氮罐保存运输，液氮冷冻研磨，低温冻干，‑80℃冰箱保存待用的烟叶末。