[发明专利]一种用分子印迹试纸条快速检测三聚氰胺的方法

摘要

本发明公开了一种用分子印迹试纸条快速检测三聚氰胺的方法。将化学聚合法制备得到的三聚氰胺分子印迹聚合物固定在试纸条上,样品中的三聚氰胺和葡萄糖氧化酶标记的三聚氰胺在与印迹孔穴进行复合反应时产生竞争，反应分子印迹膜上的葡萄糖氧化酶标记的三聚氰胺被三聚氰胺取代,随着葡萄糖氧化酶的减少，底液中的葡萄糖被氧化产生过氧化氢的量减少，荧光桃红被氧化的量也减少，采用荧光法检测时，荧光强度也相应的降低,样品中三聚氰胺的浓度在1.0×10^‑9mol/L~1.0×10^‑4mol/L范围内与荧光强度的减少量成良好的对数关系，检出限为9.0×10^‑10mol/L，实现了对三聚氰胺的快速检测。本发明具有简单、快速、成本低廉、准确可靠等优点，适用于牛奶样品中的三聚氰胺的快速检测。

主权项

1. 一种快速检测三聚氰胺的方法，其特征在于具体步骤为：(1) 三聚氰胺分子印迹聚合物的制备称取0.0020 ~ 0.0032 g N,N‑亚甲基双丙烯酰胺，加入20 mL 浓度为3×10^‑4 mol/L三聚氰胺溶液，2 ~ 7 mL分析纯α‑甲基丙烯酸，超声10分钟；静置过夜后，加入0.01 ~ 0.03 g过硫酸铵引发，反应2 ~ 7分钟，即制得三聚氰胺分子印迹聚合物，在冰箱中储存，备用；(2) 高碘酸氧化法制备葡萄糖氧化酶标记三聚氰胺称取4 ~ 6 mg葡萄糖氧化酶溶于1 mL二次水，加入0.2 mL浓度为0.1 mol/L 的NaIO₄溶液，室温下避光搅拌20分钟；将上述溶液装入透析袋中，对浓度为1 mmol/L、 pH = 4.4的HAC‑NaAC缓冲液透析，4 ℃过夜；加入20 mL浓度为 0.2 mol/L pH = 9.5碳酸盐缓冲液，使葡萄糖氧化酶的pH升高至9.0 ~ 9.5；取另一个10 mL比色管，加入8 ~ 12 mg三聚氰胺和1 mL浓度为 0.01 mol/L pH = 9.5的碳酸盐缓冲液，与上述葡萄糖氧化酶混合，室温避光搅拌2小时；往混合液中加入0.1 mL浓度为4 mg/mL的 NaBH₄混匀，4 ℃放置2小时；将上述溶液装入透析袋中，对浓度为0.15 mol/L、 pH = 7.4的PBS缓冲液透析，4 ℃过夜；透析完成后，将标记物分装入1 mL比色管中，4 ℃避光保存；(3) 试纸条的制作剪取长×宽为4 × 1 cm的塑料基底，在黑色基底区域刻出0.5 × 0.5 cm的孔穴区域，将硝酸纤维素膜贴在该孔穴区域背面，将步骤（1）制得的三聚氰胺分子印迹聚合物滴加在硝酸纤维素膜表面，分布均匀后室温条件下晾干；接着，往三聚氰胺印迹聚合物上滴加15 ~ 25 mL质量百分比浓度为25%的乙醇，洗脱2 ~ 4分钟，用二次水淋洗，以除去三聚氰胺分子印迹聚合物中的三聚氰胺和部分吸附物，晾干，从而制备得到保留有特异性识别孔穴的三聚氰胺分子印迹试纸条，避光保存；(4) 检测方法取步骤（3）制得的三聚氰胺分子印迹试纸条一支，将15 ~ 25 μL标记好的葡萄糖氧化酶标记三聚氰胺溶液滴加到已经除去模板分子的分子印迹试纸条上，孵化反应5分钟，用二次水淋洗，洗掉未孵化上去的葡萄糖氧化酶标记三聚氰胺和其他的杂质；竞争过程是在不同浓度三聚氰胺的样品中进行的，滴加15 ~25μL待测样品溶液至孵化后的试纸条上，竞争反应3分钟，用二次水冲洗；将竞争后的试纸条滴加15 ~ 25 μL包含浓度为3×10^‑4 mol/L的荧光桃红、浓度为0.02 g/mL的葡萄糖、浓度为0.1 mol/L的HAc‑NaAc缓冲液的染料底液，进行显色反应；调节荧光光度计的最大激发波长为515 nm、激发光即EX狭缝宽度为1.5 nm、发射光即EM狭缝宽度为3.0 nm，将显色反应后的试纸条置于荧光光度计中进行荧光强度检测，实现定量分析；另外，对于大批量样品的在线监测可借助半定量分析完成，即用肉眼对颜色用目视比色法进行简单判断或者用紫外灯进行拍照对比；(5) 工作曲线的绘制取步骤（3）制得的三聚氰胺分子印迹试纸条，按步骤（4）对不同浓度的三聚氰胺标准溶液进行荧光检测，记录荧光强度，绘制工作曲线；通过对工作曲线的对数回归分析可知，试纸条的荧光强度差与1×10^‑8 mol/L ~ 1×10^‑4 mol/L三聚氰胺浓度的对数呈线性关系，线性回归方程为ΔI_F = 61.19lgC + 572.83，线性相关系数达到0.9944；(6) 牛奶样品中三聚氰胺含量的测定移取300 ~ 600 μL市售牛奶样品，用浓度为0.1 mol/L、 pH = 5的醋酸醋酸钠缓冲溶液定容至10 mL，作为待测样品；取步骤（3）制得的三聚氰胺分子印迹试纸条一支，将标记好的葡萄糖氧化酶标记三聚氰胺溶液20 μL滴加到已经除去模板分子的分子印迹试纸条上，孵化反应5分钟，用二次水淋洗，洗掉未孵化上去的葡萄糖氧化酶标记三聚氰胺和其他的杂质；滴加20 μL待测样品溶液至孵化后的试纸条上，反应3分钟，用二次水冲洗；将竞争后的试纸条滴加20 μL包含浓度为3×10^‑4 mol/L的荧光桃红、浓度为0.02 g/mL的葡萄糖、浓度为0.1 mol/L的HAc‑NaAc缓冲液的染料底液，进行显色反应；将显色反应后的试纸条置于荧光光度计中进行荧光强度检测，根据工作曲线计算样品中三聚氰胺的浓度。