[发明专利]一种用于高通量测序检测的NK细胞多基因变异文库的构建方法及其应用

摘要

本发明公开了一种用于高通量测序检测NK细胞多基因变异文库的构建方法，其特征在于覆盖人类基因PDGFRA、c‑KIT、STAT3、STAT5B、JAK‑3、PI3K、TP53和K‑ras上的基因突变位点。本发明的构建方法针对多个靶序列进行单管，快速完成文库的构建，整个文库构建过程仅需要2～3小时，手动时间仅仅需要15～30分钟即可，结合高通量测序平台可以十分有效的解决目前对于临床上淋巴瘤中临床样本基础上需要对多基因、多靶点检测这一难点，且成本低廉。

主权项

一种用于高通量测序检测的NK细胞多基因变异文库的构建方法，其特征在于：覆盖人类基因PDGFRA、c‑KIT、STAT3、STAT5B、JAK‑3、PI3K、TP53和K‑ras上的基因突变位点，具体包括如下步骤：(1)针对目的基因PDGFRA、c‑KIT、STAT3、STAT5B、JAK‑3、PI3K、TP53和K‑ras设计一基本扩增引物组，该基本扩增引物组的正向引物和反向引物的5’端设有额外的2～5个T，且该2～5个T的靠近3’端的第一个T具有PNA修饰，同时该第一基本扩增引物组的Tm值相差不超过1℃，具体的，该基本扩增引物组包括KIT‑1‑F、KIT‑1‑R、KIT‑2‑F、KIT‑2‑R、KIT‑3‑F、KIT‑3‑R、KIT‑4‑F、KIT‑4‑R、KIT‑5‑F、KIT‑5‑R、PDG‑1‑F、PDG‑1‑R、PDG‑2‑F、PDG‑2‑R、PDG‑3‑F、PDG‑3‑R、KRAS‑1‑F、KRAS‑1‑R、KRAS‑2‑F、KRAS‑2‑R、KRAS‑3‑F、KRAS‑3‑R、P53‑1‑F、P53‑1‑R、P53‑2‑F、P53‑2‑R、P53‑3‑F、P53‑3‑R、P53‑4‑F、P53‑4‑R、P53‑5‑F、P53‑5‑R、P53‑6‑F、P53‑6‑R、P53‑7‑F、P53‑7‑R、P53‑8‑F、P53‑8‑R、JAK3‑1‑F、JAK3‑1‑R、STAT3‑1‑F、STAT3‑1‑R、STAT3‑2‑F、STAT3‑2‑R、STAT5B‑1‑F、STAT5B‑1‑R、PI‑1‑F、PI‑1‑R、PI‑2‑F和PI‑2‑R，其序列依次如SEQ ID 01～SEQ ID 50所示；(2)设计一不对称连接探针组与一不与人类基因组形成互补的通用引物，不对称连接探针组含有多对不同的不对称连接探针，每对不对称连接探针均包括可自身形成环状的一正向探针和一反向探针，该正向探针和反向探针从3’端至5’端均依次包括一能够与不对称连接探针的5’端若干连续碱基配对的互补序列、一与所述通用引物互补配对的扩增序列和一与上述2～5个T相对应的粘性末端识别序列，同时各正向探针和反向探针均具有相应的标签序列，上述每对不对称连接探针的正向探针和反向探针的Tm值相差不超过1℃，具体的，所述不对称连接探针组包括Ion‑BC1‑FF、Ion‑BC1‑FR、Ion‑BC1‑RF、Ion‑BC1‑RR、Ion‑BC2‑FF、Ion‑BC2‑FR、Ion‑BC2‑RF、Ion‑BC2‑RR、Ion‑BC3‑FF、Ion‑BC3‑FR、Ion‑BC3‑RF、Ion‑BC3‑RR、Ion‑BC4‑FF、Ion‑BC4‑FR、Ion‑BC4‑RF、Ion‑BC4‑RR、Ion‑BC5‑FF、Ion‑BC5‑FR、Ion‑BC5‑RF、Ion‑BC5‑RR、Ion‑BC6‑FF、Ion‑BC6‑FR、Ion‑BC6‑RF、Ion‑BC6‑RR、Ion‑BC7‑FF、Ion‑BC7‑FR、Ion‑BC7‑RF、Ion‑BC7‑RR、Ion‑BC8‑FF、Ion‑BC8‑FR、Ion‑BC8‑RF和Ion‑BC8‑RR，其序列依次如SEQ ID 51～SEQ ID 82所示，上述BC1～8分别表示八种不同的标签序列；(3)将模板、上述基本扩增引物组置于一含有RingCap‑Taq酶的PCR反应体系中进行扩增，纯化后得扩增产物；将上述扩增产物、不对称连接探针组、通用引物和上述RingCap‑Taq酶混合进行PCR，纯化后获得所述用于高通量测序检测的NK细胞多基因变异文库；上述RingCap‑Taq酶由Taq酶、DNA连接酶和DNA末端修饰酶组成。