[发明专利]一种诱导成纤维细胞转分化为神经细胞的方法

摘要

本发明公开了一种诱导成纤维细胞转分化为神经细胞的方法，步骤如下：(1)培养成纤维细胞20～30h；(2)将细胞转移到含诱导小分子组合6TCF的培养基中继续培养6～8天，期间每2～4天更换一次培养基；(3)将细胞再转移到含诱导小分子组合6TCF和8CFV的培养基中继续7～16天，期间每2～4天更换一次培养基，获得神经细胞；其中，6为E616452、T为苯环丙胺、C为CHIR99021、F为毛喉素、8为A‑83‑01、V为丙戊酸。本发明通过在培养基中添加诱导小分子组合，能够将成纤维细胞诱导转分化为神经细胞，所得神经细胞具有正常神经细胞的特异性分子标签，并且具有正常神经细胞的功能，为再生医学的细胞来源问题提供一种新的途径。

主权项

1.一种诱导成纤维细胞转分化为神经细胞的方法，其特征在于，步骤如下：/n(1)小鼠胚胎成纤维细胞的制备步骤如下：/n1)培养器皿的预处理：以0.2％明胶覆盖培养皿的底壁，室温下放置30min后，将0.2％明胶吸出，室温下备用；/n2)给孕13.5天的小鼠注射约0.5mL阿佛丁麻醉后，实施断颈法处死小鼠，将其浸入75％酒精中消毒5分钟；/n3)用75％乙醇擦拭腹部，剪开皮肤并把皮肤向后拉，暴露出腹壁，剪开腹壁以暴露出子宫，将子宫移到100mm的皿里，用10mL PBS洗三遍；/n4)用剪刀剪开胚囊，并将胚胎移到培养皿中；/n5)小心去除胚胎的头和内脏，将胚胎躯干部分转移到青霉素小瓶中，用2mL PBS洗三遍；/n6)用眼科剪将组织剪碎，加入2mL的0.05％胰蛋白酶和0.02％EDTA，将悬液移入50mL离心管中，并在37℃孵育大约20min，每隔5min振荡几下；/n7)充分吹打后加入10mL培养基终止消化，静置5min后，将上层约8mL的细胞悬液移入培养皿中，置37℃，5％CO2培养6h后，换液；/n8)细胞约90％汇合时传代；/n(2)将步骤(1)制备的小鼠胚胎成纤维细胞接种在35mm细胞培养皿上，每个培养皿接种20000个细胞，其培养基为基础培养基；第二天，更换培养基，并加入诱导小分子组合6TCF，每4天更换一次添加诱导小分子组合6TCF的培养基；第9天至第24天，更换为添加诱导小分子组合6TCF和8CFV的培养基，第24天获得神经细胞；/n其中，诱导小分子组合6TCF中各组分的使用浓度为：5μM E616452、5μM苯环丙胺、10μMCHIR99021、10μM毛喉素；诱导小分子组合8CFV中各组分的使用浓度为：0.5μM A-83-01、10μM CHIR99021、10μM毛喉素、500μM VPA。/n