[发明专利]色霉素A2、A3的生物合成及提纯工艺

摘要

本发明公开了一种色霉素A2、A3的生物合成及提取纯化工艺，包括下述步骤1）SrcmRI基因过表达工程菌SR1的构建；2）SrcmRII基因敲除工程菌SR2的构建；3）SrcmRI基因过表达和SrcmRII基因敲除工程菌SR3的构建；4）将步骤1）‑3）构建的工程菌在液体培养基中的发酵及产物萃取获得色霉素提取液；5）将步骤1）‑3）构建的工程菌在固体培养基上的培养及产物萃取获得色霉素提取液；6）将步骤4）或步骤5）中的色霉素提取液进行纯化和分析获得最终产物色霉素A2和色霉素A3。本发明通过基因工程菌的构建形成；产量高，副产物少，产物提纯工艺简单；操作过程易控制，无污染，生产成本低。

主权项

一种色霉素A2、A3的生物合成及提纯工艺，其特征在于：其包括下述步骤：1）SrcmRI基因过表达工程菌SR1的构建；2）SrcmRII基因敲除工程菌SR2的构建；3）SrcmRI基因过表达和SrcmRII基因敲除工程菌SR3的构建；4）将步骤1）‑3）构建的工程菌在液体培养基中的发酵及产物萃取获得色霉素提取液；5）将步骤1）‑3）构建的工程菌在固体培养基上的培养及产物萃取获得色霉素提取液；6）将步骤4）或步骤5）中的色霉素提取液进行纯化和分析获得最终产物色霉素A2和色霉素A3；所述步骤1）的具体工程如下：以纯化的链霉菌roseiscleroticus野生型菌株基因组DNA为模板，使用引物14‑2‑SARP‑F‑XbaI‑NdeI: 5’‑AATCTAGAGGAGGAGCCCATATGAGCTCCGACAGCGACTGCA‑3’ 和引物14‑2‑SARP‑R‑XbaI: 5’‑AATCTAGATCAGCCGGCCCGGCGCTGCC‑3’，通过聚合酶链式反应扩增激活基因SrcmRI片段，扩增反应的条件为98℃ 15秒，60℃ 15秒，72℃ 30秒，30个循环，利用限制性核酸内切酶HindIII和XbaI将上述扩增得到的基因片段连接到大肠杆菌‑链霉菌穿梭载体pSET152的XbaI位点，即得所需的SrcmRI基因过表达质粒pZJ183，将该pZJ183质粒通过原生质体转化导入链霉菌roseiscleroticus野生型菌株，即得所需的重组工程菌株SR1；所述步骤2）的具体工程如下：以纯化的链霉菌roseiscleroticus野生型菌株基因组DNA为模板，使用左臂引物PadRout‑left‑F‑EcoRI: 5’‑AAAGAATTCTACTCGCCGGAGTGCGCACGGTCGAA‑3’、PadRout‑left‑R‑XbaI: 5’‑AAATCTAGACTTCTTCGCGCAGCTTGCGCAGCT‑3’和右臂引物PadRout‑right‑F‑XbaI: 5’‑AAATCTAGACGTACCGCTGTCGCCGCGAT‑3’、PadRout‑right‑R‑HindIII: 5’‑AAAAAGCTTATGATCTCGATCATCGAGCG‑3’，通过聚合酶链式反应扩增一个包含有无功能∆SrcmRII基因的2.3 kb片段，扩增反应的条件为98℃ 15秒，60℃ 15秒，72℃ 100秒，30个循环；将上述扩增得到的片段克隆到大肠杆菌‑链霉菌穿梭载体pKC1139的EcoRI/HindIII位点，即得所需的SrcmRII基因敲除质粒pZJ196，通过接合作用将基因敲除质粒pZJ196导入到链霉菌roseiscleroticus野生型菌株，将包含基因敲除质粒pZJ196的链霉菌roseiscleroticus菌株在MS固体培养基上28℃下培养20天，再分别挑取单菌落到3 mL的TSBY液体培养基中，在28℃下培养5天，然后取50 μL培养液涂布到ISP4固体培养基上；在37℃下培养5天，长出的菌株即为所需的单交换突变株，将上述筛选得到的单交换突变株接种到不含有安普霉素的TSBY固体培养基上，在28℃下培养3代，然后挑选相同克隆分别接种到含有安普霉素的TSBY固体培养基与不含有安普霉素的TSBY固体培养基上，在37℃下培养5天，筛选出不能在含有安普霉素的TSBY固体培养基上生长，但能够在不含有安普霉素的TSBY固体培养基上生长的菌落，即为所需的双交换突变工程菌株SR2。