[发明专利]一种黄曲霉毒素B1半抗原、人工抗原及其卵黄抗体的制备方法

摘要

本发明公开了一种黄曲霉毒素B₁半抗原、人工抗原及其高灵敏度、高特异性卵黄抗体的制备方法。本发明首先将黄曲霉毒素B₁分子上双呋喃环中的碳碳双键进行加成反应引入游离羧基形成黄曲霉毒素B₁半抗原，其结构式如式（I）所示：式（I）；再将该半抗原与载体蛋白偶联得到黄曲霉毒素B₁人工抗原；由该人工抗原乳化后免疫鸡，得到黄曲霉毒素B₁卵黄抗体。所述抗体对黄曲霉毒素B₁的半抑制浓度（IC₅₀）为4.23ng/mL，定量检测范围为0.29~61.83ng/mL，检测限为0.06ng/mL，且该抗体对AFB₂、AFG₁和AFG₂的交叉反应率均低于1%。本发明的抗体同时具备高灵敏、特异性的特点，具有广阔的应用前景。

主权项

1.一种黄曲霉毒素B1卵黄抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）将黄曲霉毒素B1溶解于乙腈后，与乙醇酸和三氟乙酸进行反应，反应产物经乙酸乙酯和饱和食盐水萃取后，用无水硫酸钠干燥，最后液相纯化得到黄曲霉毒素B1半抗原；（2）将步骤（1）所述黄曲霉毒素B1半抗原经活泼酯法和BSA偶联得到黄曲霉毒素B1人工抗原；（3）用黄曲霉毒素B1人工抗原（1mg/mL）300 µL，按体积比1:1与弗式完全佐剂乳化，免疫产蛋鸡，之后将等体积的AFB1‑GA‑BSA与弗式不完全佐剂乳化，每隔三周加强免疫一次，共加强免疫三次；（4）首次免疫后当天开始收集鸡蛋，标记后4℃保存备用；（5）鸡蛋洗净后用75%酒精棉擦拭蛋壳，去蛋壳，去蛋清，用针头将蛋黄膜轻轻挑破，流出的卵黄液用0.06 mol/L的NaAc按1:9体积稀释，边搅拌边加入终浓度为8%的辛酸，室温放置20 min，8000 r/min离心20 min，过滤去沉淀，获得去脂的卵黄水溶提取物（WSF）；（6）再加入40%的饱和硫酸铵溶液，室温放置20 min，12000 r/min离心20 min，分离上清及沉淀，所得沉淀即为黄曲霉毒素B1‑IgY抗体；步骤（1）所述黄曲霉毒素B₁半抗原的分子结构如式（）所示：式（I）。