[发明专利]一种基于发卡结构的目标区域捕获方法及其应用

摘要

本发明公开了一种基于发卡结构的目标区域捕获方法及其应用，包括上下游引物设计，发卡结构形成，上游引物扩增产物消化、纯化，及下游引物富集扩增过程。本发明仅有上游引物3’端扩增的产物能与上游引物5’端形成发卡结构的区域被捕获，因而特异性强；形成的发卡结构序列特殊，使得下游引物组可以对目标捕获区域进行指数扩增，因而极少量基因组即可达到后续检测需要，灵敏度高；用于本方法的引物组可以通过DNA芯片技术合成引物池，因而可以同时检测数千个目标区域，实现高、低通量的兼容；本发明的方法设计简单，仅需设计目标捕获区域的上下游引物，避免固相或液相捕获方法的设计大量全区域捕获探针的麻烦；检测成本低。

主权项

1.一种基于发卡结构的目标区域捕获方法，其特征在于，包括以下步骤：第1步、向包含目标捕获区域的基因组试样中，加入至少一条上游引物，进行单向扩增反应并形成发卡结构；第2步、将第1步的单向扩增产物置于冰上，冷却；第3步、采用单链DNA外切酶对第2步的非特异性扩增产物进行消化，并利用磁珠富集法进一步纯化，收集具有发卡结构的目标捕获序列；第4步、向具有发卡结构的目标捕获序列中加入至少一条下游引物，进行富集扩增；所述方法中采用的上游引物为SEQ ID NO:1～41，下游引物为SEQ ID NO:42～82；所述上游引物的5’端序列为目标捕获区域下游的反向互补序列，3’端为目标捕获区域上游特异性扩增序列；其中，上游引物的所述5’端序列的Tm值大于55℃；所述下游引物为上游引物中所述5’端序列。