[发明专利]Tregs相关因子的检测方法及SAM联合沙利度胺在抗肿瘤免疫中的应用

摘要

本发明涉及肝癌的治疗及预后判断技术领域，具体公开一种Tregs相关因子的检测方法及SAM联合沙利度胺在抗肿瘤免疫中的应用，检测方法包括体外检测和体内检测，在检测过程中选取最佳作用浓度做为联合用药组的干预浓度；体外培养肝癌HepG2细胞，选取对数生长期的细胞，随机分成4组空白对照组、SAM组、沙利度胺组、以及联合用药组，检测各因子的情况及变化；用H22肝癌腹水瘤细胞构建荷瘤肝癌小鼠模型，小鼠随机分为4组生理盐水组、SAM组、沙利度胺组，沙利度胺联合SAM组，连续腹腔注射10d，每隔7d测量移植瘤长短径，检测各因子的情况及变化。本发明的优点是，明确S‑腺苷蛋氨酸、沙利度胺联合应用对于肝癌细胞增值、迁移和凋亡的效果，SAM联合沙利度胺共同限制Tregs活性，增强抗肿瘤免疫效果。

主权项

Tregs相关因子的检测方法，其特征在于：包括体外检测和体内检测，在检测过程中选取最佳作用浓度做为联合用药组的干预浓度；体外检测：体外培养肝癌HepG2细胞，选取对数生长期的细胞，随机分成4组：空白对照组、SAM组(2、4、6mmol/L)、沙利度胺组(50、100、200μg/ml)、以及联合用药组(SAM与沙利度胺联合)，具体包括以下步骤：1)MTT实验观察空白对照组、SAM组、沙利度胺组作用24、48、72h后细胞的生长曲线、Transwell实验观察细胞运动能力的变化、流式细胞术检测细胞周期和凋亡情况，选取最佳作用浓度做为联合用药组干预浓度，使用上述方法检测联合用药组作用24、48、72h后细胞的增值、迁移及凋亡情况；2)采用流式细胞术检测4组作用48h后，Tregs相关细胞因子CD4+CD25+T细胞、TGF‑β、IL‑10的表达；3)利用RT‑PCR方法检测4组作用48h后，Foxp3mRNA、NF‑κβ表达；4)焦磷酸测序法检测4组作用48h后，Foxp3启动子区甲基化水平的变化；体内检测：用H22肝癌腹水瘤细胞构建荷瘤肝癌小鼠模型，40只模型小鼠随机分为4组，每组10只：生理盐水组、SAM组、沙利度胺组，沙利度胺联合SAM组，连续腹腔注射10d，每隔7d测量移植瘤长短径，并于第28天处死小鼠，具体包括以下步骤：1)采用流式细胞术检测外周血Tregs百分比、以及相关细胞因子TGF‑β、IL‑10的表达；2)用RT‑PCR方法检测各组移植瘤组织Foxp3、NF‑κβmRNA含量；3)焦磷酸测序法检测各组移植瘤组织Foxp3启动子区甲基化水平的变化；4)免疫组化检测各组移植瘤组织Foxp3、NF‑κβ蛋白表达。