[发明专利]一种分子标记微珠及基于该分子标记微珠的高通量单细胞测序方法

摘要

本发明公开了一种分子标记微珠及基于该分子标记微珠的高通量单细胞测序方法。一种用于高通量单细胞测序的分子标记微珠，包括微珠本体和偶联的作为分子标记的寡核苷酸链，所述寡核苷酸链包括：通用引物序列，作为PCR扩增时的引物结合区域；多聚T尾，与mRNA的poly A序列结合；分子标签序列，标识结合的mRNA；细胞标签序列，标识mRNA取自的细胞。本发明分子标记微珠的分子标记序列分为4个功能区，分别为通用引物序列、细胞标签序列、分子标签序列和多聚T尾，基于该分子标记微珠的高通量单细胞测序方法能够一次性获得上万个单细胞的特异性转录组信息，且整套实验成本低、时间短、通量高，具有很好的应用价值。

主权项

1.一种高通量单细胞测序方法，其特征在于，所述步骤为：（1）将细胞加入到微孔板中，然后加入分子标记微珠，所述分子标记微珠包括微珠本体和偶联的作为分子标记的寡核苷酸链，所述寡核苷酸链包括：通用引物序列，作为PCR扩增时的引物结合区域；多聚T尾，与mRNA的poly A序列结合；分子标签序列，标识结合的mRNA；和细胞标签序列，标识mRNA取自的细胞，其中微孔板上的微孔直径大小为刚好容纳一个细胞和一个分子标记微珠；并且所述的分子标记的序列如下：5’‑TTTAGGGATAACAGGGTAATAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGTnnnnnnCGACTCACTACAGGGnnnnnnTCGGTGACACGATCGnnnnnnNNNNNNTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT‑3’；所述微珠本体为磁珠；并且，单个分子标记磁珠上连接106~7条所述的分子标记序列；（2）加入裂解液，孵育；（3）收集分子标记微珠‑mRNA复合物，进行逆转录PCR，获得带有所述分子标记的cDNA；（4）构建测序文库，进行高通量测序，其中所述的高通量测序是一次性获得上万个单细胞的特异性转录组信息；其中，所述微珠本体的直径为15~25μm；所述细胞加入微孔板中的落孔率控制在8%~12%；并且所述分子标记微珠加入微孔板中的落孔率大于99%。