[发明专利]使用HLA-G阳性间充质干细胞治疗系统性红斑狼疮的方法

摘要

本发明涉及使用HLA‑G阳性间充质干细胞治疗系统性红斑狼疮的方法。具体地说，本发明一方面涉及制备用于治疗系统性红斑狼疮的人白细胞抗原‑G阳性的间充质干细胞的方法，该方法包括以下步骤：(1)分离培养HLA‑G+脐带间充质干细胞、(2)HLA‑G+间充质干细胞冻存、(3)HLA‑G+间充质干细胞复苏。本发明方法所制得的间充质干细胞中有90％以上的细胞人白细胞抗原‑G呈阳性。已经发现，本发明HLA‑G+脐带间充质干细胞在治疗系统性红斑狼疮方面具有优异的治疗效果。

主权项

1.制备用于治疗系统性红斑狼疮的人白细胞抗原‑G阳性的间充质干细胞的方法，该方法包括以下步骤：步骤(1)、分离培养HLA‑G+脐带间充质干细胞(11)采集脐带后，放入运输液中低温保存，带回实验室12h内进行处理；取培养基中5cm长的脐带组织置于超净工作台，D‑HANKS溶液反复冲洗管腔及血管，洗去残留的血液直到冲洗液清澈；(12)纵行剖开脐带，将血管、尿管、管周及内外膜组织钝性撕掉；(13)用微量加样器取少量培养液到T25培养瓶中润湿培养瓶底部，弃去多余的培养液，将去血管后的组织剪碎到1mm×1mm×1mm大小的组织块，D‑HANKS溶液反复冲洗，450×g、4℃离心10min，丢弃离心管下面的杂质细胞，重复3次；(14)取清洗离心后的组织块，以0.5cm的间距放置到湿润了的T25培养瓶中，每个瓶中放置30个组织块，共放置10个培养瓶；置于37℃、5%CO2培养箱中孵育，以后每天用300μl的培养液湿润组织块，再弃去多余的液体，当有细胞从组织块中游出后，逐渐向培养瓶中增加培养液，当达到70%~80%融合度时，将贴壁细胞和组织块分别传代；(15)传代培养：(15a)贴壁细胞传代：清洗：将培养瓶中的培养基吸出并弃去，吸取D‑HANKS液加入每个培养瓶中，为5ml/T25培养瓶，将培养瓶横放并轻轻晃动，使D‑HANKS液能充分清洗细胞表面，吸出D‑HANKS液并弃去；消化：每瓶加入一定量的25%胰酶，盖上瓶盖，将培养瓶横放，使胰酶覆盖细胞表面，室温消化2‑5分钟，在倒置显微镜下观察细胞状态，当所有细胞均变圆并脱离培养瓶时，轻拍培养瓶壁，使所有细胞脱落并悬浮于培养瓶中，显微镜下观察确保所有细胞均脱落后，将培养瓶移至生物安全柜中；中止：每瓶加入2~5mL完全培养基，混匀，中止胰酶消化；收集：用移液管吸取培养瓶中的细胞悬液，并收集至50ml离心管中，再用D‑HANKS液冲洗培养瓶，确保所有细胞均被收集；离心：将离心管放入台式离心机中，配平，调整转速1500rpm，时间5分钟，升速9，降速7，开始离心；重悬：离心结束后，取出离心管，放入生物安全柜中，吸出上清液并弃去，用完全培养基重悬细胞沉淀，将多管细胞悬液合并为一管，混匀后取样计数及检测细胞存活率；分选：细胞计数后用适当的培养液重悬细胞，浓度为1×10⁷个/mL；分装为100μL，采用直接标记的一抗，分别加入CD11b、CD73、CD90、CD105、CD34、CD45、HLA‑G抗体于冰上孵育30min，采用流式细胞仪分选CD73+CD90+CD105+HLA‑G+CD11b‑CD34‑CD45‑细胞；传代：将分选后细胞转入T25培养瓶中，每个培养瓶中补足3ml培养液，以后每周换2次液；细胞融合达到70‑80%后，对细胞进行消化传代，在消化前一天全量换液；细胞消化计数，按1：3传代，2‑3天细胞铺满底部，漩涡状密集分布，生长较一致；(15b)组织块传代：将有细胞游出的组织块小心挑出，移入新的培养皿，间隔5mm种植；加少量完全培养基湿润底部即可，待其贴壁后再补加一定量的完全培养基；待观察到有细胞从组织块游出后，隔天换液，游出组织块细胞2~3d迅速生长达到80%~90%的融合度，再次将细胞和组织块分别传代，方法同上面针对贴壁细胞传代的操作；共传代3次；细胞消化计数；步骤(2)、HLA‑G+间充质干细胞冻存(21)配制冻存液：按1份DMSO：2份人血清白蛋白：7份完全培养基比例配制并添加重量/体积百分数为0.01%~0.03%的焦磷酸钠，根据计数结果和冻存密度计算冻存液体积，冻存液需多配制10ml用于无菌检测，将配好的冻存液放入4度冰箱预冷；(22)离心：将待冻存细胞悬液离心，调整转速1500rpm，时间5分钟，升速9，降速7，开始离心；(23)混合与分装：细胞离心后移至生物安全柜，吸取并弃去上清液，加入一定体积的冻存液重悬细胞沉淀，混合均匀以后，按照固定的体积将细胞悬液分装至2ml冻存管中，放入冻存盒4度冰箱预冷30分钟；(24)程序降温：打开程序降温仪，设定好降温程序，输入细胞批号，连接液氮供给罐，启动程序，使程序降温仪腔体温度降至4度，将预冷好的冻存盒放入程序降温仪，开始降温，整个降温过程为90分钟；(25)液氮储存：取出完成降温的冻存盒，放入冻存架中，放入MVE液氮储存罐中，填写完成储存位置表；步骤(3)、HLA‑G+间充质干细胞复苏(31)准备工作：打开水浴锅，配制完全培养基；(32)取细胞：根据所需细胞数量计算取出细胞管数，在细胞库存管理台账中记录取出时间和取出管数，并在储存位置表中相应位置进行标记；打开液氮储存罐，找到相应冻存架和冻存盒位置，取出细胞；(33)解冻：将细胞放入37度水浴锅中，迅速晃动，使细胞在1分钟内解冻；(34)去冻存液：由于冻存液中的DMSO在常温下对细胞有伤害作用，因此需迅速将解冻好的细胞悬液转移至装有完全培养基的离心管中；(35)离心：将装有细胞悬液的离心管放入离心机，调整转速1500rpm，时间5分钟，升速9，降速7，开始离心；(36)接种：将完全培养基移至培养瓶中，将离心后的细胞上清液吸出并弃去，使用完全培养基重悬细胞沉淀，加入培养瓶中，混匀后贴标签，放入二氧化碳培养箱中培养；传至P4~P6代，得到可用于临床治疗的HLA‑G+间充质干细胞。