[发明专利]一种产顺式-4-羟脯氨酸的方法有效
| 申请号： | 201610895160.6 | 申请日： | 2016-10-14 |
| 公开（公告）号： | CN106434782B | 公开（公告）日： | 2020-01-10 |
| 发明（设计）人： | 陈可泉;张博文;王昕;钱娟;蔡沛沛;欧阳平凯 | 申请（专利权）人： | 南京工业大学 |
| 主分类号： | C12P13/24 | 分类号： | C12P13/24;C12N15/70;C12R1/19 |
| 代理公司： | 32285 南京先科专利代理事务所(普通合伙) | 代理人： | 叶帅东 |
| 地址： | 211816 江*** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | 本发明公开了一种产顺式‑4‑羟脯氨酸的方法，该方法通过在宿主菌细胞内构建过表达脯氨酸羟化酶基因Ecp4H，利用CRISPR‑Cas9技术抑制脯氨酸降解途径中脯氨酸羟化酶基因 | ||
| 搜索关键词： | 一种 顺式 羟脯氨酸 方法 | ||
【主权项】：
1.一种产顺式-4-羟脯氨酸的方法，其特征在于，通过在宿主菌细胞内构建过表达脯氨酸羟化酶基因Ecp4H，利用CRISPR-Cas9 技术抑制脯氨酸降解途径中脯氨酸脱氢酶基因putA以及α-酮戊二酸降解途径中琥珀酸脱氢酶基因sucA、sucB，异柠檬酸裂解酶基因aceA和异柠檬酸激酶基因aceK的表达得到重组菌株，并将重组菌株发酵培养后获取全细胞，最后全细胞转化生产顺式-4-羟脯氨酸；具体的方法包括以下步骤：步骤1，配种子培养基、发酵培养基、反应液、soc 培养基、菌体洗液，并与培养皿、锥形瓶、离心管一起灭菌后备用；步骤2，构建得重组质粒pET-28a-Ecp4H，pACYC-CAS9 及质粒pCDF-sucA-sucB-aceA-aceK，并/n转入宿主菌细胞内37℃下培养12-14h 得菌种；步骤3，向离心管中依次接入种子培养基、抗生素和菌种后，摇床上培养9-10h 得发酵菌种；步骤4，向锥形瓶中依次接入发酵培养基和发酵菌种，摇床培养至OD 至少为0.6，再加入至终浓度为0.8-1.2mmol 的IPTG，诱导培养后离心8-10min，倒掉上清，收集菌体，用菌体洗液洗涤2-4 遍后得备用菌体；步骤5，向灭菌后锥形瓶中依次加入反应液和备用菌体，加入缓冲溶液，并用KOH 调节pH 至中性，进行全细胞催化反应，反应中并用磷酸调节pH 至中性，其中，备用菌体的干重为0.41g/L；步骤6，每隔5-8h 取样一次，并通过液相检测产物，待全细胞催化55-65h 时结束得产物顺式-4-羟脯氨酸。/n
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