[发明专利]诱导脂肪间充质干细胞向软骨细胞分化的培养方法

摘要

本发明涉及一种诱导脂肪间充质干细胞向软骨细胞分化的培养方法。为解决现有技术分化率低问题。步骤有1)、脂肪间充质干细胞原代细胞的分离2)、脂肪间充质干细胞扩增、传代3)、P5代脂肪干细胞向软骨细胞分化培养脂肪间充质干细胞在传P5代后加入条件培养基，即脂肪间充质干细胞向软骨分化培养基，进行向软骨细胞分化培养，每三天进行细胞换液，同时观察了细胞的形态学变化，诱导16天后进行阿利新蓝染色鉴定脂肪间充质干细胞成软骨分化情况。阿利新兰染色鉴定是显微镜下可见软骨细胞形成，且阿利新蓝染色呈阳性。具有简单易行，诱导培养基为无血清培养系统，诱导时间短，实验重复性好，成骨细胞分化率高的特点。

主权项

一种诱导脂肪间充质干细胞向软骨细胞分化的培养方法，其特征在于步骤有：1)、脂肪间充质干细胞原代细胞的分离：吸脂来源的脂肪组织洗去血细胞和混合的少量纤维结缔组织，同时对脂肪进行涂平a板检测，确保实验前脂肪无污染；离心后脂肪组织在下层，去掉上层血水后将离心管下层的脂肪分散，加入2倍体积I型胶原酶和trypLETM消化酶溶液混合物溶液混合物，37℃消化3045分钟后停止酶解，离心弃去上清液；并用筛网过滤，得脂肪问充质干细胞悬液；2)、脂肪间充质干细胞扩增、传代：获得的脂肪间充质干细胞接种到培养瓶中，置于37℃、饱和湿度、5％的CO2培养箱中进行原代细胞培养，细胞培养到80‑90％融合时，用trypLETM消化，按分种率1∶4‑‑1∶6接种到新培养瓶中培养，在培养瓶中加入间充质干细胞生长培养基培养P4代脂肪源间充质干细胞：细胞生长达到80％融合，用DPBS洗液洗多遍后，加入胰酶‑EDTA进行消化，显微镜下观察，细胞呈现圆球状态时，用自体血清终止消化，将细胞吸入离心管中，充分混匀后，取样计数，其余细胞悬液离心，倒掉离心后的上清，以1∶3的比例传代，培养至P4代；3)、P5代脂肪干细胞向软骨细胞分化培养：(1)取P4代细胞生长达到70‑80％融合，用DPBS洗液洗多遍后，加入trypLETM进行消化，显微镜下观察，细胞呈现圆球状态时，用人血清终止消化，将细胞收集到离心管中，充分混匀后，离心，倒掉离心后的上清，加入DPBS洗液，混匀后再次离心，倒掉上清，再次加入DPBS洗液，混匀后，取样计数，其余细胞悬液离心，离心后去掉上清；备用做脂肪干细胞向软骨细胞分化培养；(2)用间充质干细胞生长培养基重悬细胞，调整细胞浓度；将细胞悬液加入多孔板中，放入37℃，5％CO2细胞培养箱中，约24小时后，换加入诱导分化培养基，每三天更换一次诱导分化培养基；16‑18天后，进行阿利新兰染色鉴定和倒置显微镜下观察细胞生长状况合格后，完成向软骨细胞分化的培养；所述诱导分化培养基为由DMEM高糖培养液，5％血清替代物，100u/ml青霉素，100g/ml链霉素，10ng/ml的转化生长因子‑β1，转铁蛋白5μg/ml，抗坏血酸50ug/ml，地塞米松10‑7mol/L，丙酮酸钠6.25ug/ml，维生素C浓度25ug/mL配制成的无血清诱导培养液。