[发明专利]RT‑qPCR检测Wistar大鼠黄嘌呤脱氢酶/氧化酶基因转录水平的方法在审
| 申请号： | 201610898422.4 | 申请日： | 2016-10-15 |
| 公开（公告）号： | CN106498042A | 公开（公告）日： | 2017-03-15 |
| 发明（设计）人： | 王陈芸;唐东红;叶尤松;李哲丽;马开利;鲁帅荛;黄璋琼 | 申请（专利权）人： | 中国医学科学院医学生物学研究所 |
| 主分类号： | C12Q1/68 | 分类号： | C12Q1/68 |
| 代理公司： | 昆明正原专利商标代理有限公司53100 | 代理人： | 徐玲菊,蒋文睿 |
| 地址： | 650106 云*** | 国省代码： | 云南;53 |
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| 摘要： | 本发明公开一种RT‑qPCR检测Wistar大鼠黄嘌呤脱氢酶/氧化酶基因转录水平的方法，设计引物，以大鼠新鲜肝脏组织提取的总RNA为模板，按常规逆转录合成得大鼠肝脏组织cDNA第一链；建立大鼠GAPDH基因及XDH/XO基因标准曲线，大鼠肝脏提取的总RNA经实时荧光定量PCR检测收集荧光与所得溶解峰标准曲线比较，即得到Wistar大鼠黄嘌呤脱氢酶/氧化酶基因转录水平。通过本发明的引物可对大鼠黄嘌呤脱氢酶/氧化酶基因转录水平的变化情况实施定量检测，其操作简单，可重复性高，特异性强，灵敏度好。本发明为研究大鼠黄嘌呤脱氢酶/氧化酶基因的功能及影响因素提供了有效工具。 | ||
| 搜索关键词： | rt qpcr 检测 wistar 大鼠 黄嘌呤 脱氢酶 氧化酶 基因 转录 水平 方法 | ||
【主权项】：
一种RT‑qPCR检测Wistar大鼠黄嘌呤脱氢酶/氧化酶基因转录水平的方法，其特征在于包括下列步骤：（1）设计下列引物：大鼠XDH/XO基因表达水平的特异性上、下游引物组合及对应的核苷酸序列为：XDH/XO F：5＇‑ATGCGGACCCTGAAACAACA‑3＇XDH/XO R：5＇‑TGTTCTGAAGACGGTCATACTTGGA‑3＇；作为内参基因的大鼠GAPDH基因的特异性上、下游引物组合及对应的核苷酸序列为：GAPDH F：5＇‑GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG‑3＇GAPDH R：5＇‑ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA‑3＇；（2）以大鼠新鲜肝脏组织提取的总RNA为模板，按常规逆转录合成得大鼠肝脏组织cDNA第一链；（3）建立大鼠GAPDH基因及XDH/XO基因标准曲线：以Esidilution梯度稀释步骤（2）大鼠肝脏组织cDNA第一链，分别稀释为10‑1、10‑2、10‑3、10‑4倍浓度，以原始cDNA第一链及稀释后的cDNA为模板，进行实时荧光定量检测，以步骤（1）中的XDH/XO F和XDH/XO R以及GAPDH F和GAPDH R为特异性引物，分别在下列PCR扩增体系下：25μL体系，SYBR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) 12.5μL，正向、反向引物各1μL，cDNA模板1μL，去离子水9.5μL，进行下列实时荧光定量PCR扩增：94℃预变性30s，94℃变性5s、59℃退火30s、40个循环，59℃到94℃每5s采集一次荧光，得到大鼠GAPDH基因及XDH/XO基因的溶解曲线和标准曲线；（4）大鼠肝脏提取的总RNA经实时荧光定量PCR检测收集荧光与步骤（3）所得溶解峰标准曲线比较，即得到Wistar大鼠黄嘌呤脱氢酶/氧化酶基因转录水平。
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