[发明专利]一种带侧链的D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶固定化酶的制备方法

摘要

本发明提供了一种带侧链的D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶固定化酶的制备方法，是构建表达带侧链的D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶的工程菌，进行发酵培养得到菌体，然后破碎细胞获得带侧链的D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶的上清液，再用离子交换树脂吸附酶，得到带侧链的D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶固定化酶。利用这种方法固定化酶，无需对酶进行分离纯化，可以根据调节pH值的大小改变酶蛋白的带电量，并利用酶分子连接的带电荷的寡聚氨基酸侧链与离子交换树脂之间的电荷吸附作用将酶蛋白固定在树脂上，操作简单，并且酶与载体之间的结合力强不易脱落，可以反复多次使用，在降低成本的基础上可用于连续生产或在反应器中进行搅拌反应，应用前景广阔。

主权项

一种带侧链的D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶固定化酶的制备方法，步骤是：(1)构建表达带侧链的D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶的工程菌；(2)按1％的接种量将步骤(1)的工程菌接种于LB培养基中，在37℃，200rpm条件发酵培养2～4h，当OD值达到0.6后，用终浓度为0.1mM的IPTG，37℃，200rpm诱导过夜，然后再于4℃，8000rpm离心收集菌体，并用pH值为8.0的0.1M的磷酸盐缓冲液洗涤菌体，再4℃，8000rpm离心收集得到菌体；(3)按每1g菌体中加入10mL磷酸盐缓冲液的比例向获得的菌体中加入pH值为8.0的0.1M的磷酸盐缓冲液，利用细胞破碎仪破碎15±5min后，在4℃，8000rpm条件离心，收集带侧链的D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶的上清液；(4)在带侧链的D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶的上清液中按比例加入离子交换树脂，在4℃，120rpm条件吸附固定化10±3h，得到吸附有带侧链的D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶的树脂；(5)用pH值为8.0的0.1M的磷酸盐缓冲液洗涤制备的树脂3～5次，以洗去游离的酶液，得到带侧链的D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶固定化酶，4℃保存，备用；其特征在于：步骤(1)所述构建表达带侧链的D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶工程菌的方法是：①以报道的D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶核苷酸序列为模板，设计引物，进行PCR克隆反应，获得带侧链的D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶的基因序列；其中相关引物的核苷酸序列是：DPE‑12‑NdeI上游：5’‑GGGAATTCCATATGAAATATGGTATTTATTACGCT‑3’；DPE‑12‑XhoI下游：5’‑CCGCTCGAGTCAATCTTCGTCCTCATCTTCGTCCTCATCTTCGTCGTCGACTTCAAATACATGTT‑3’；②获得的带侧链的D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶的基因命名为DPE‑12，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，利用DNA纯化回收试剂盒对目的基因产物进行回收；③用限制性内切酶NdeI和XhoI分别对回收的目的基因产物和质粒载体pET22b进行双酶切，利用DNA纯化回收试剂盒分别回收酶切后的DPE‑12和质粒片段，然后利用T4连接试剂盒将DPE‑12和质粒片段进行连接；④将③中的连接液转化大肠杆菌E.coli DH5α，利用Amp‑LB平板筛选，获得的阳性克隆进行测序分析，测序无误的阳性克隆扩大培养，提取质粒，命名为表达质粒pET22b‑DPE‑12；⑤将表达质粒pET22b‑DPE‑12转化大肠杆菌BL21，利用Amp‑LB平板筛选获得阳性转化子，验证无误的阳性转化子命名为BL21‑pET22b‑DPE‑12，即获得表达带侧链的D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶的工程菌；步骤(4)所述离子交换树脂为碱性阴离子交换树脂；其加入量是按1mL酶上清液加1g树脂的比例在带侧链的D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶的上清液中加入离子交换树脂。