[发明专利]一种终止lncRNA双等位基因转录的方法有效
| 申请号： | 201610905097.X | 申请日： | 2016-10-17 |
| 公开（公告）号： | CN106544360B | 公开（公告）日： | 2019-11-05 |
| 发明（设计）人： | 崔恒宓;刘洋洋 | 申请（专利权）人： | 扬州大学 |
| 主分类号： | C12N15/85 | 分类号： | C12N15/85 |
| 代理公司： | 南京钟山专利代理有限公司 32252 | 代理人： | 戴朝荣 |
| 地址： | 225009 江*** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | 本发明提供了一种终止lncRNA双等位基因转录的方法，包括以下步骤：1)构建分别含有两种不同抗生素筛选基因的CMV‑抗生素筛选基因‑PolyA DNA片段；2)根据不同靶向基因设计gRNA，构建Cas9/gRNA表达载体；3)在靶向基因中插入步骤1)中所得的CMV‑抗生素筛选基因‑PolyA DNA片段，构建含有靶向基因的同源重组载体；4)导入细胞：将步骤3)中所获得的含有靶向基因的一对同源重组载体，以及步骤2)中所获得的含有靶向基因的Cas9/gRNA表达载体共转染细胞；5)使用步骤1)中所使用的相关抗生素筛选至少2周，获取lncRNA双等位基因被敲除的多克隆细胞株；该方法可以实现以达到在高效定点插入的同时，快速获得lncRNA双等位基因同时敲除的细胞株的目的。 | ||
| 搜索关键词： | 一种 终止 lncrna 等位基因 转录 方法 | ||
【主权项】：
1.一种终止lncRNA双等位基因转录的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)构建两种分别含有不同抗生素筛选基因的CMV‑抗生素筛选基因‑PolyA DNA片段；2)根据不同靶向基因设计不同的gRNA，构建含有靶向基因的Cas9/gRNA表达载体；3)在靶向基因中插入步骤1)中所获得的分别含有不同抗生素筛选基因的CMV‑抗生素筛选基因‑PolyA DNA片段，构建含有靶向基因的同源重组载体，其中，所述同源重组载体包括能够有效地转录抗性基因并保证细胞表达足够抵抗抗生素的抗性蛋白的启动子、抗生素筛选基因和转录终止信号PolyA DNA片段，其中，每对同源重组载体的两个所述同源重组载体之间具有不同的抗生素筛选基因，所述PolyA DNA片段位于抗生素筛选基因下游；4)导入细胞：将步骤3)中所获得的含有靶向基因的一对同源重组载体，以及步骤2)中所获得的含有靶向基因的Cas9/gRNA表达载体共转染细胞；5)使用步骤1)中所使用的抗生素基因的相关抗生素筛选至少2周，获取lncRNA双等位基因被敲除的多克隆细胞株。
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