[发明专利]一种基于聚合酶等温扩增技术检测重金属离子的方法

摘要

本发明涉及一种基于磁性核‑壳纳米粒子和聚合酶等温扩增反应信号放大技术检测重金属镍离子的方法，属于分析化学或环境监测技术领域。利用自组装技术，将DNA链S1通过Au‑S键固定到Fe₃O₄@Au核‑壳磁性纳米粒子表面。镍离子（Ni²⁺）存在时，核酸链S1在酶位点被Ni²⁺切割，核酸链S1的5′端的部分碱基缺失导致其3′端核酸链成为单链，继而与另一条互补序列的DNA单链S2发生杂交结合。当加入聚合酶和底物dNTP后，在S2的诱导延伸作用下促使S1打开并发生等温扩增放大反应，最后将亚甲基蓝MB嵌入到双链DNA空隙，形成的复合物在金磁电极表面通过磁性富集实现电化学响应信号的放大。根据电化学信号的增强实现对溶液中Ni²⁺的测定，该法具有高灵敏度、高选择性、简单、快速等特点。

主权项

1.一种基于聚合酶等温扩增反应信号放大技术检测金属离子的电化学方法，其特征是将含DNA酶且可部分自杂交的核酸链S1通过Au‑S键固定到金包裹的磁性纳米粒子表面；Ni²⁺存在时，核酸链S1的DNA酶位点被Ni²⁺切割，核酸链S1的5′端的部分缺失导致3′端核酸链成为单链，互补序列DNA单链S2与S1单链部分杂交；当加入聚合酶和底物dNTP后，在S2的诱导延伸作用下促使S1打开并发生等温扩增放大反应，最后将亚甲基蓝MB嵌入到双链DNA空隙，形成的复合物在金磁电极表面通过磁性富集实现电化学响应信号的放大，根据电化学信号的增强实现溶液中的Ni²⁺浓度的测定，包括以下步骤：（1）DNA序列的设计本发明所设计的DNA序列如下：S1：5’‑ACT CAC TAT︱RA︱GGA AGA GAT GGA CGT GAG TCG ACT AGA CAC GTC CAT CTC TGC AGT CGG GTA GTT AAA CCG ACC TTC AGA CAT AGT GAG TAG CA ‑3’‑SH；S2：5’‑CTA CTC ACT ATG TCT‑3’；（2）Fe₃O₄@Au核‑壳磁性纳米粒子的制备首先采用共沉淀法在碱性条件下制备Fe₃O₄磁性纳米粒子，通过3‑氨丙基三乙氧基硅烷对其表面进行氨基化，之后利用柠檬酸钠还原HAuCl₄·4H₂O水溶液，在Fe₃O₄粒子表面形成金壳，得到Fe₃O₄@Au核‑壳磁性纳米粒子；（3）双链DNA标记Fe₃O₄@Au粒子的制备将Fe₃O₄@Au粒子与核酸链S1在37℃下反应12 h，孵化，磁分离，得到S1标记的Fe₃O₄@Au，将Ni²⁺与S1标记的Fe₃O₄@Au在37℃下孵化1 h，核酸链S1的DNA酶位点被Ni²⁺切割，S1的5′端的部分缺失导致3′端核酸链成为单链，于95℃加热5 min，之后核酸链S2与S1单链部分于37℃杂交3 h形成双链DNA，得到双链DNA标记的Fe₃O₄@Au磁性纳米粒子；（4）聚合酶等温扩增反应双链DNA标记的Fe₃O₄@Au溶液中，于37℃下加入聚合酶和底物dNTP反应2 h，在S2的诱导延伸作用下促使S1打开并发生等温扩增放大反应，最后与亚甲基蓝MB在37℃反应3 h，使MB嵌入到双链DNA空隙，形成的复合物在金磁电极表面通过磁性富集实现电化学响应信号的放大；（5）分析检测使用电化学工作站进行电化学响应信号的检测，根据电化学响应信号的大小对标准溶液或样品溶液中Ni²⁺浓度进行定量测定。