[发明专利]一种人类视网膜色素上皮细胞层的分离培养方法在审

专利信息
申请号: 201610911776.8 申请日: 2016-10-19
公开(公告)号: CN106282096A 公开(公告)日: 2017-01-04
发明(设计)人: 李宁;谢磊;范国平;吕志刚;方攀峰 申请(专利权)人: 江苏艾尔康生物医药科技有限公司
主分类号: C12N5/071 分类号: C12N5/071
代理公司: 无锡市大为专利商标事务所(普通合伙)32104 代理人: 曹祖良,张仕婷
地址: 214028 江苏省无锡市新*** 国省代码: 江苏;32
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摘要: 发明涉及一种人类视网膜色素上皮细胞的分离培养方法,属于生物医学技术领域。其通过缓冲液浸泡清洗、分离、酶溶液浸泡清洗、清洗、消化和培养重悬对RPE细胞进行分离培养。本发明利用生物加机械方法分离出胎儿来源的人类视网膜色素上皮细胞,即RPE细胞,并进行体外培养。本发明提供的对人类RPE细胞层分离培养方法步骤简单易操作;在细胞分离的过程中能最大限度的保存RPE细胞层的完整性;在细胞分离过程中能完整的将RPE细胞层与脉络层分离开,获得的细胞纯度高;后续培养中细胞纯度高、均一性高、增殖能力出色、能更早的分化成具有典型形态的细胞;为体外培养、扩增RPE细胞,治疗AMD等RPE细胞损伤提供了新来源。
搜索关键词: 一种 人类 视网膜 色素 上皮细胞 分离 培养 方法
【主权项】:
一种人类视网膜色素上皮细胞的分离培养方法,其特征是步骤为:(1)缓冲液浸泡清洗:将待处理的眼球放入加有青霉素‑链霉素的DPBS缓冲液浸泡中浸泡4~6min;将浸泡完毕的眼球用DPBS缓冲液清洗1~3次,每次8~12s;(2)分离:对步骤(1)所得眼球分离角膜和虹膜,去除晶状体和玻璃体,轻轻挤压,使眼杯展开,去除神经层;(3)酶溶液浸泡清洗:将步骤(2)所得视杯转移到1~3mL 1X的分离酶溶液中,在37℃下消化20~30min;(4)清洗:将步骤(3)所得视杯转移到DPBS缓冲液中,从视杯中揭下RPE细胞层,并将RPE细胞层转移到5~10mL的DPBS缓冲液中,1800‑2200rpm离心5~10min;(5)消化:离心结束后吸除上清,加入1~2mL 质量浓度为0.25%的TE缓冲液,在37℃下消化5~10 min;(6)培养重悬:在步骤(5)所得消化后的RPE细胞层中加入4~8mL RPE培养基,1800~2200rpm离心5~10min,吸除上清再用2~4mL RPE培养基重悬,然后接种到cell‑start基质胶包被的六孔板的一孔中;培养至第三天换液,然后每隔两天换液一次,直到细胞达到覆盖90%时传代。
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