[发明专利]一种紫黑翼蚌钩介幼虫体外培养的方法

摘要

本发明涉及一种紫黑翼蚌钩介幼虫体外培养的方法，属于淡水蚌类繁育技术领域。其包括选择成熟且活力好的紫黑翼蚌钩介幼虫，通过悬浮快速沉降法清洗幼虫，制备特定鱼血浆，配置特定幼虫体外培养液配方，在无二氧化碳的控温培养条件下实现钩介幼虫的变态发育，最后采用自来水逐步稀释替换培养液，唤醒变态稚蚌。本发明采用改进的体外培养方法和特定培养液配方首次实现了蚌类斧头型钩介幼虫的非寄生变态发育，在没有特定寄主鱼的限制条件下，突破了我国紫黑翼蚌人工繁育关键技术瓶颈，不仅使蚌类钩介幼虫体外培养技术和理论得到了完善和提高，对蚌类人工繁育及增殖保护具有重要应用价值。

主权项

1.一种紫黑翼蚌钩介幼虫体外培养的方法，其特征是步骤为：（1）选种：检查紫黑翼蚌孕育蚌育儿囊发育情况，选择成熟且活力良好钩介幼虫用于体外培养；（2）幼虫获取：采用注射器从孕育蚌育儿囊后端中部垂直刺入，将5～10mL L‑15培养液注射入育儿囊内并缓慢抽出注射器，将每个鳃间隔中的钩介幼虫冲出，流入容器中，用吸管吹打使幼虫分散；再加入300～500mL L‑15培养液清洗幼虫，通过悬浮快速沉降3～5次，完全去除孕育蚌组织、幼虫碎片及污染物；（3）特定鱼血浆的制备：取500～800g健康的斜带髭鲷，采用肝素钠溶液润湿无菌注射器，对斜带髭鲷尾静脉无菌采血，将采得的血样在0～4℃条件下以2000～3000r/min转速离心10～20min；取上清液，用0.45µm无菌过滤膜过滤1次，‑80℃冻存，使用前再采用0.22µm无菌过滤膜过滤2次，得到特定鱼血浆；（4）混合抗生素溶液配制：在每100mL无菌纯水中加入50～100µg羧苄青霉素二钠、50～100µg硫酸庆大霉素、50～100µg发霉素和2.5～5µg两性霉素B，充分溶解后采用0.22µm无菌膜过滤1次，4℃保存备用；（5）幼虫培养液的配置：按L‑15培养液：步骤（3）制备的特定鱼血浆：步骤（4）制备的混合抗生素溶液体积比2:（0.8‑1.5）:0.5取液混合，配置得到幼虫培养液；（6）培养：在无菌操作台中，将步骤（5）制备所得3.5mL幼虫培养液加入无菌培养皿中，加入清洗好的钩介幼虫，数量控制在100～400只/培养皿；将培养皿置于温控培养箱内，温度控制在23～25℃；每3d更换一次步骤（5）制备所得新鲜的幼虫培养液；在培养20～24d后幼虫完成变态发育，向培养皿中逐步加入充分曝气的自来水唤醒稚蚌，水温保持在23～25℃；6～8h内稀释替换至自来水含量大于95%，即完成培养。