[发明专利]一种基于Fe3O4纳米探针的EGFR免疫组化检测试剂盒及其使用方法

摘要

本发明公开了一种基于Fe3O4纳米探针的EGFR免疫组化检测试剂盒及其使用方法。所述试剂盒包括：柠檬酸修复粉剂；内源性过氧化物酶阻断剂；非特异性结合位点阻断剂；DAB浓缩液；DAB显色底物；DAB稀释液；Fe3O4纳米探针；TBS粉剂；苏木素染色液。本发明给出了一种新的纳米颗粒偶联抗体的方法，巧妙地将Fe3O4纳米颗粒的高类过氧化物酶活性和EGFR单域抗体的生物特性结合起来，得到的Fe3O4纳米探针表面负载较多的EGFR单域抗体。所述Fe3O4纳米探针由表面携带金属离子的Fe3O4纳米颗粒与C端带有His‑Tags的EGFR单域抗体配位形成，具有尺寸小，稳定性好，特异性高、灵敏度高和催化活性高的优点。通过所述试剂盒可以方便快捷地检测肿瘤病理组织EGFR表达水平，从而为肿瘤治疗提供依据。

主权项

1.一种基于Fe3O4纳米探针的EGFR免疫组化检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括以下成分：(1)柠檬酸修复液，所述柠檬酸修复液为10mmol/L、pH值为6.0的柠檬酸‑柠檬酸钠去离子水溶液；(2)即用型内源性过氧化物酶阻断剂，所述阻断剂为浓度为3wt％的H2O2；(3)非特异性结合位点阻断剂，所述非特异性结合位点阻断剂为牛血清白蛋白(BSA)粉剂；(4)3，3’‑二氨基联苯胺四盐酸盐(DAB)干粉；(5)3，3’‑二氨基联苯胺四盐酸盐(DAB)显色底物，所述显色底物为双氧水；(6)3，3’‑二氨基联苯胺四盐酸盐(DAB)稀释液，所述稀释液为水或者7.4缓冲液；(7)Fe3O4纳米探针；(8)TBS粉剂，所述TBS粉剂为配制pH值为7.4的吐温磷酸盐缓冲液所用粉剂；(9)苏木素染色液；所述Fe3O4纳米探针的制备方法包括以下步骤：(1)将FeCl3·6H2O和FeSO4·7H2O按照质量比为1‑1.5∶0.75‑1.5溶于纯水中，在氮气保护下，在50℃～80℃之间的某一温度下恒温水浴中搅拌，并加入氨水反应；然后滴加8～10mL油酸，在50℃～80℃之间的某一温度下恒温水浴反应1～5h；(2)将步骤(1)得到的反应液温度升至85℃～100℃，使氨水全部挥发，冷却之后，转移至容器中，磁分离、洗涤，然后溶解在正己烷中保存，得到Fe3O4@OA正己烷溶液；(3)取步骤(2)中制备的Fe3O4@OA正己烷溶液与浓度为2mg/mL的二巯丁二酸的丙酮溶液按质量比1∶1～4混合，然后在60℃下冷凝回流3‑10h，磁分离、洗涤，得到磁性颗粒；(4)将步骤(3)中得到磁性颗粒使用纯水定容，用氢氧化钠调节pH至9‑11，超声分散后，用盐酸调节pH至6‑8，装入透析袋，透析，得到Fe3O4纳米颗粒；(5)取步骤(4)中制备的Fe3O4纳米颗粒与NiSO4·6H2O、Co(NO3)2·6H2O、MgSO4·7H2O或CaCl2·6H2O水溶液混合、孵育，在10000r/min的速度下离心，取沉淀重悬于超纯水中，得到表面携带Ni2+、Co2+、Mg2+或Ca2+的Fe3O4纳米颗粒分散液；(6)将步骤(5)中得到的表面携带Ni2+、Co2+、Mg2+、或Ca2+的Fe3O4纳米颗粒与EGFR单域抗体进行混合、孵育，在10000r/min的速度下离心，取沉淀得到Fe3O4纳米探针；(7)将步骤(6)中得到的Fe3O4纳米探针用含有1wt％牛血清白蛋白的pH值为7.4的PBS缓冲液溶解，并放置在恒温容器中于3℃～4.5℃之间的某一温度下保存。