[发明专利]一种利用短芽胞杆菌制备脑钠肽前体抗原表位的方法

摘要

发明公开了一种利用短芽胞杆菌(Bacillus brevis，B.brevis)制备脑钠肽前体抗原表位的方法。该方法将能与脑钠肽前体抗体结合的脑钠肽前体N端线性抗原表位(NT‑BNP_12‑21)核苷酸序列置换人纤维连接蛋白(fibronectin 3，Fn3)编码FG区的核苷酸序列，构成Fn3与NT‑BNP_12‑21线性表位融合基因，插入到穿梭质粒pNCMO₂的P2信号肽下游，构建pNCMO₂‑Fn3‑NT‑BNP_12‑21重组质粒，使得该重组质粒在B.brevis中能高效表达分泌型的骨架蛋白Fn3融合NT‑BNP_12‑21线性表位的融合蛋白。本发明可以简单、快速、高效、低成本地制备分泌型的具有和脑钠肽前体抗原性相当的融合蛋白。

主权项

1.一种利用短芽胞杆菌制备脑钠肽前体抗原表位的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)、人纤维连接蛋白Fn3展示NT‑BNP_12‑21线性表位融合蛋白表达载体构建：(1)将NT‑BNP_12‑21线性表位设计在Fn3的FG区，在FG loop区引入编码BNP线性表位的短肽序列，按照SEQ ID NO:1构成人纤维连接蛋白Fn3与NT‑BNP_12‑21线性表位融合基因Fn3‑BNP_12‑21，合成Fn3展示NT‑BNP_12‑21线性表位的基因片段，在融合基因5′末端引入编码6个组氨酸的分离纯化标签，便于分离纯化；(2)将步骤(1)中得到的引入分离纯化标签的融合基因Fn3‑BNP_12‑21通过Nco Ⅰ和Xho Ⅰ酶切位点构建到穿梭载体pNCMO₂的P2强启动子下游，形成融合表达载体pNCMO₂‑Fn3‑BNP_12‑21；2)、人纤维连接蛋白Fn3展示NT‑BNP_12‑21线性表位融合蛋白的表达：(1)将融合表达载体pNCMO₂‑Fn3‑BNP_12‑21转化至大肠杆菌中，在氨苄青霉素抗性的LB平板上筛选阳性克隆，氨苄青霉素在LB培养基的终浓度为100μg/ml，LB培养基配方为每升培养基中含胰蛋白胨10克、酵母提取物5g、氯化钠10g和15g琼脂粉；(2)将鉴定过的阳性转化子转化至短芽孢杆菌中，在新霉素抗性的MT培养基平板上筛选阳性克隆，新霉素在MT培养基终浓度为10μg/ml，MT培养基配方为每升培养基中含葡萄糖20g、多价胨10g、肉浸粉5g、酵母提取物20g、FeSO₄·7H₂O 10mg、MnSO₄·4H₂O 10mg、ZnSO₄·7H₂O 1mg，pH＝7.2‑7.4；(3)将鉴定过的阳性转化子接种在含有新霉素的MT或2SY液体培养基中，新霉素在液体培养基终浓度为50μg/ml，过夜培养，收集上清培养液，利用SDS‑PAGE电泳及Western Blot法检测目的蛋白条带，2SY培养基配方为每升培养基中含葡萄糖20g、大豆胨40g、酵母提取物5g、CaCl₂·2H₂O 0.15g，pH＝7.2‑7.4；3)、融合蛋白的分离纯化：收集上清培养液，用镍柱纯化带有His‑Tag标签的融合蛋白，该蛋白即为重组人源Fn3融合N‑端脑钠肽前体抗原表位BNP_12‑21蛋白。