[发明专利]牙鲆正常和白化皮肤细胞系的构建方法

摘要

本发明属于海洋生物细胞培养技术领域，具体涉及牙鲆正常和白化皮肤细胞系的构建方法，首先配制细胞培养液，以牙鲆正常和白化皮肤组织为材料，漂洗剪碎后，直接置于装有适量细胞培养液的25cm2培养瓶中，24℃培养。以后每隔5天更换细胞培养液，待原代细胞生长为单层时，用0.25％的胰蛋白酶消化细胞进行传代；8‑10天传代1次，传至第10代时，细胞培养液中血清含量由20％减为10％，此时细胞系建立成功。利用这种方法获得的牙鲆细胞系形态为成纤维样，可以连续传代40代以上，细胞系可以直接应用于病原特性研究、疫苗研制及功能基因研究；该构建方法适用于其他鱼类构建皮肤细胞系。

主权项

牙鲆正常和白化皮肤细胞系的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一：配制细胞培养液：取DMEM/F12培养基和Hepes，充分溶解混合均匀4h后，用NaOH调节pH值，然后抽滤，将滤液分装，于4℃保存，使用时，取滤液加入胎牛血清、50mm的2‑巯基乙醇、10ng/ml人碱性成纤维细胞生长因子、100U/ml青霉素、0.1mg/ml硫酸链霉素，并于4℃存放，所述胎牛血清的体积为DMEM/F12培养基体积的20％；步骤二：原代培养：首先配置冲洗液，所述的冲洗液包括DMEM/F12培养基、100U/ml青霉素和0.1mg/ml硫酸链霉素，然后分别取体重200克正常牙鲆和白化牙鲆，分别用MS‑222麻醉之后，用70％酒精浸泡清洗4min，取正常牙鲆、白化牙鲆的有眼侧皮肤分别置于不同的细胞培养皿中，使用冲洗液冲洗三次，将皮肤组织剪成1mm3的小块后，分别放入25cm2的培养瓶中，向培养瓶中补充细胞培养液至完全覆盖皮肤组织块，并正置于24℃的培养箱中培养，最后每隔5天更换细胞培养液一次；步骤三：传代培养：原代培养细胞开始迁移增殖后，细胞数目增多，细胞生长成为单层后，采用0.25％胰酶消化法传代悬起细胞，并以1：1—1：2进行传代，以后8‑10天传代一次，传至第10代时，细胞培养液中胎牛血清含量减为总体积的10％，此时，细胞系建立成功。