[发明专利]一种匙吻鲟心脏细胞系的构建方法

摘要

本发明属于细胞培养技术领域，涉及一种匙吻鲟心脏组织细胞系的构建方法所述方法具体步骤为选取健康的匙吻鲟，将漂洗过的心脏组织，除去心耳，用杜氏磷酸盐缓冲液清洗数次，消化，然后加入过量的完全培养液终止消化，过滤，将滤液离心，弃上清液，用完全培养液悬浮沉淀细胞，培养。本发明构建的匙吻鲟心脏细胞系增殖速度快，可以连续传代，并可超低温冻存和复苏，既可为鲟鱼类种质资源保存的相关研究奠定技术基础，又可作为鲟鱼病毒病体外研究的理想材料。

主权项

一种匙吻鲟心脏组织细胞系的构建方法，其特征在于，所述方法具体步骤为：1）选取健康的匙吻鲟，先用自来水冲去鱼的体表粘液及污物，后经 20ppm 高锰酸钾溶液药浴 10～20 分钟，再以75% 乙醇消毒体表，无菌条件下解剖取心脏组织，用预冷的杜氏磷酸盐缓冲液连续漂洗若干次；2）将漂洗过的心脏组织，除去心耳，剪成 1mm3 的小块，用杜氏磷酸盐缓冲液清洗数次，消化，然后加入过量的完全培养液终止消化，过滤，将滤液离心，弃上清液，用完全培养液悬浮沉淀细胞，调整细胞浓度至 5×105 个/ml，接种细胞到培养瓶中，每瓶加入的完全培养液，25℃条件下，二氧化碳培养箱中静置培养，每隔 2～3 天更换完全培养液1次，继续培养 3～5 天后，细胞可形成单层或细胞簇，按 1：2 的方式进行传代培养；3）将长满致密单层的匙吻鲟心脏细胞培养瓶弃去培养基，用pH7.4无菌的杜氏磷酸缓冲液洗涤数次，再加入0.25% 胰酶溶液，25℃培箱中消化18‑25分钟，待细胞单层解离成单个细胞后，加入完全培养液以中和过量的胰酶溶液，1000~1600 r/min 离心3‑6 分钟，收集细胞并用完全培养液重悬细胞沉淀，将重悬后得到的细胞悬液分别等量接种于两个培养瓶中，25℃培养箱中进行传代培养，每隔3‑4d 待细胞再次长满单层后，重复传代培养的步骤，得到传代培养的细胞；4）在DMEM基础培养液中加入二甲基亚砜，胎牛血清，青霉素、链霉素、两性霉素B，配制成细胞冷冻保存液，置冰上预冷，取传代培养的细胞，用胰酶将单层细胞消化后，离心弃除培养基，将细胞沉淀用预冷的冷冻保存液重悬，转入冻存管中，将冻存管放入冻存盒中进行连续降温后，置入液氮中保存；复苏时，从液氮里取出冻存细胞，迅速投入37℃水浴解冻，离心重悬细胞沉淀，用移液枪将该细胞移入培养瓶，加入完全培养液，25℃恒温培养12‑24h 后更换新鲜匙吻鲟心脏细胞完全培养液，得到贴壁生长的匙吻鲟心脏组织细胞，即完成匙吻鲟心脏组织细胞系的构建。