[发明专利]一种敲除wecA降低克雷伯氏菌荚膜多糖含量的方法

摘要

本发明公开了通过Red重组系统敲除了不位于荚膜多糖合成基因簇上但在荚膜多糖前期合成中起重要作用的wecA基因。结果表明，K.pneumoniae ΔwecA发酵甘油合成1,3‑丙二醇的产量提高9.9％，达到20.29g/L，荚膜含量降低了59.5％，表明敲除参与荚膜前期合成的wecA基因能够有效阻断荚膜合成，降低荚膜含量、提高发酵产量。且由于在克雷伯氏菌的毒性因子中荚膜多糖占主要地位，因此推测该缺失菌株的致病性将降低，更有利于工业化生产PDO。

主权项

1.一种弱化克雷伯氏菌荚膜多糖的方法，其特征在于，通过Red重组系统敲除了克雷伯氏菌染色体上不位于荚膜多糖合成基因簇上但在荚膜多糖前期合成中起重要作用的wecA基因，从而使得菌株的荚膜多糖含量减少，进而降低发酵液的粘度，有利于PDO后期的分离纯化提取，在缺失菌株中PDO的产量也有所提升， 包括以下步骤A.以pKD13为模板，以上游引物：GGCATCATCGCTATACTTCCCGGATTAACTATGCTGAGAGCACATGCGTTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC和下游引物：CGTTCACTGCTTGTGCTCCCGGTAATGGTTGAGTCATCACATCCCCAGCTCTGTCAAACATGAGAATTAAPCR扩增获得敲除wecA基因所需的打靶片段；B.将A中所克隆的片段电转入含有氯霉素抗性的pKD46质粒的克雷伯氏菌中，并筛选出阳性菌；C.消除B中阳性菌株中的pKD46质粒，然后电转入pCP20质粒，进行kan标记的剔除， 并PCR筛选出阳性菌株，此菌株即为缺失了wecA基因的克雷伯氏菌。