[发明专利]一种胰岛素的固相合成方法

摘要

本发明公开一种胰岛素的固相合成方法，包括以下步骤：以Fmoc固相合成法分别合成胰岛素的A链和B链，其中半胱氨酸分别采用不同侧链保护基的原料进行缩合反应，A链采用片段缩合法合成，得到裸肽肽链；然后采用液相环化法分别形成胰岛素的第一对二硫键、第二对二硫键和第三对二硫键，得到胰岛素纯品多肽。本发明通过工艺优化，胰岛素纯品纯度到达90％，纯品收率达到10％以上，大大提高了胰岛素的得率；本发明操作简单，反应过程取样方便，易于中控，并且合成周期短，产品收率高，利于工业化生产。

主权项

1.一种胰岛素的固相合成方法，其特征在于，该方法包括以下顺序的合成制备步骤：/n(1)、采用Fmoc固相合成法，将溶胀、脱保护并洗涤后的树脂载体与活化的保护氨基酸溶液于30℃的恒温震荡器中反应40-90min，其中，半胱氨酸分别采用mmt、acm和trt保护基的原料进行缩合反应，依次接入肽链序列中相对应的保护氨基酸，A链采用片段缩合法合成，得到A链片段一、A链片段二和B链裸肽肽链如下；/nA链片段一：LYQLENYC(Trt)N/nA链片段二：GIVEQC(Mmt)C(Acm)TSIC(Mmt)S/nB链裸肽：FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT/n(2)、将A链片段二裸肽纯化、冻干，然后进行液相环化，形成胰岛素的第一对二硫键；/n(3)、将A链片段一和片段二进行缩合反应，得到A链裸肽肽链，将纯化后的A链裸肽和B链裸肽分别溶解，进行液相环化，形成胰岛素的第二对二硫键；/n(4)、将形成第二对二硫键胰岛素多肽进行纯化、冻干，样品溶解后进行液相环化，形成胰岛素的第三对二硫键，将得到的样品纯化、冻干，得到胰岛素产品；/n步骤(1)中所述的树脂载体，片段一采用Wang Resin，片段二和B链采用2-Cl(Trt)-ClResin，所述保护氨基酸的活化方法为：将保护氨基酸和HOBt加入到离心管中，加入DMF将其溶解，再用滴管向溶液中加入DIC，混合使其完全溶解；所述半胱氨酸的保护基，其中形成胰岛素第一对二硫键的半胱氨酸采用Fmoc-Cys(mmt)-OH，形成胰岛素第二对二硫键的半胱氨酸采用Fmoc-Cys(acm)-OH，形成胰岛素第三对二硫键的半胱氨酸采用Fmoc-Cys(trt)-OH；/n步骤(2)中所述的液相环化法，首先以特有的切割试剂配方7％TFA+87％DCM+2.5％Tis+2.5％H