[发明专利]一种从绿藻分离纯化小分子寡糖的方法

摘要

本发明提供了一种从绿藻分离纯化小分子寡糖的方法，包括以下步骤：(1)原料粉碎；(2)超声波提取；(3)真空浓缩；(4)DEAE‑纤维素层析柱分离；(5)PAGE凝胶电泳；(6)采用苯酚硫酸法测定糖含量；(7)采用BCA法测定多肽含量；(8)抗肿瘤细胞活性测定。

主权项

1.一种从绿藻分离纯化小分子寡糖的方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)原料粉碎：绿藻加2～8倍体积的水用组织捣碎机打碎至均匀状态；(2)超声波提取：将绿藻匀浆后放入超声波提取设备，温度50～80℃，超声波频率20～60KHz，提取时间1～4h，功率50W；悬浮液经粗滤后得初步提取液；残渣用2～8倍体积水再次加热超声波提取1～4h，悬浮液经粗滤后得次步提取液；合并两次提取液；(3)真空浓缩：合并后的提取液放入真空抽滤瓶，先铺一层5000MWCO滤膜，再放上两层滤纸，真空浓缩过滤液；得初浓缩液；而滤过液再以同法1000MWCO滤膜作第二次过滤,加去离子水至8～10倍体积后再抽滤，得次浓缩液；分別回收初、次浓缩液转入离心管，在12000rpm转速下离心5min，得样品溶液；(4)DEAE‑纤维素层析柱分离：将DEAE‑纤维素层析柱依次用10倍体积的0.5M HCl、去离子水、0.5M NaOH、去离子水、0.5M NaCl、去离子水的顺序交替洗脱处理至pH＝7；将浓度为50‑200mg/5ml的样品溶液上样后，以10倍体积的去离子水洗柱，收集5ml/管；再以40倍体积0.0～5.0M NaCl溶液梯度洗脫；从每管取0.05ml样品，测硫酸寡糖含量；所述硫酸寡糖的含量测定采用Alcian blue法：取1克Alcian blue 8GS溶于18mM硫酸制成储备液，所述储备液按照1:100配比稀释后加入TritonX‑100至0.25％终浓度，形成Alcian blue工作液，然后采用0.2μm滤膜过滤，采用酶标仪在A600nm波长读数；混合1倍体积硫酸寡糖样品并分别采用6‑硫酸软骨素0.1‑1.0mg/ml、1倍体积4M盐酸胍、0.375％Triton X‑100、27mM硫酸和10倍体积的Alcian blue工作液加入96孔测试板，在4℃以16000rpm转速下离心10min；弃上清液后加30倍体积8M盐酸胍并剧烈混匀；再以16000rpm转速下离心10min后转移20倍体积上清液至一新的96孔测试板，采用酶标仪在A600nm波长读数；合并峰值管，测硫酸寡糖总含量，并计算回收率；冷冻浓缩，加乙醇调浓度至75～85％，静置12h后过滤得小分子寡糖沉淀，冷冻干燥得干燥硫酸寡糖；(5)PAGE凝胶电泳：称量干燥硫酸寡糖溶于去离子水形成浓度为1.0mg/ml硫酸寡糖溶液，取1倍体积硫酸寡糖溶液并分别采用浓度为1.0mg/ml 8kDa硫酸葡聚糖，1kDa葡聚糖，3kDa葡聚糖，4kDa葡聚糖作为标准液，混合2倍体积5x上样液，加入4～20％PAGE样品槽，在20mM巴比妥钠缓冲液以100v电泳30min；以0.1％甲苯胺蓝溶于1％HAc染色1小时，1％HAc脫色1小时，反复三次直到底色完全清晰；(6)采用苯酚硫酸法测定糖含量：将5倍体积硫酸寡糖溶液并分别采用2mM葡萄糖，半乳糖，甘露糖，岩藻糖作为标准液加入96孔测试板，加15倍体积浓硫酸并混匀，再加3倍体积浓度为5％的苯酚水溶液；在90℃水浴孵育5min后，擦干板底，采用酶标仪在A490nm波长读数；(7)采用BCA法测定多肽含量：采用结晶牛血清白蛋白采用生理盐水配制成1.5mg/ml的蛋白质标准液，采用酶标仪在A490nm波长读数；(8)抗肿瘤细胞活性测定：将人宫颈癌细胞株Hela培养于96孔培养板，每孔104细胞数，以含10％牛血清的DMEM培养液，在37℃，5％CO2培养箱培养4小时；换以100倍体积新鲜培养液分别加入含0，50，100，200，400μg/ml硫酸寡糖溶液并继续在37℃培养72小时；加入2倍体积WST‑1后再培养4小时，采用酶标仪在A450nm波长读数；癌细胞抑制率＝100×(1‑样品读数/空白读数)。