[发明专利]高通量液相色谱串联质谱的检测方法以及检测4种儿茶酚胺代谢物的方法

摘要

本发明公开了一种高通量液相色谱串联质谱的检测方法，所述方法包括：S1样品制备、S2衍生化反应、S3样品前处理、S4液相色谱分离以及S5串联质谱检测等步骤；此外，本发明还公开了一种高通量液相色谱串联质谱法检测4种儿茶酚胺代谢物的方法，该方法提供了一种适用于人血浆中儿茶酚胺代谢物检测，并且样品前处理简单、可以同时检测4种儿茶酚胺代谢物、检测特异性好、整个检测流程时间短、通量高的检测方法。

主权项

1.高通量液相色谱串联质谱法检测4种儿茶酚胺代谢物的方法，所述方法包括以下步骤：S11标准品制备：将儿茶酚胺的4种代谢物甲氧基肾上腺素、甲氧基去甲肾上腺素、香草扁桃酸和高香草酸的标准品分别用乙腈稀释到若干个不同浓度备用，每个浓度的标准品中加入等量的含有已知浓度内标的乙腈溶液，高速离心后取上清液，进行冻干；S12衍生化反应：避光条件下利用丹磺酰氯进行衍生化反应使得其与甲氧基肾上腺素、甲氧基去甲肾上腺素、香草扁桃酸和高香草酸发生化学反应以提高在质谱上的信号响应信号，衍生化反应还加入适量0.1M Na2CO3–NaHCO3缓冲溶液，衍生反应条件为35℃避光30 min；S13样品前处理：反应完后把混合溶液pH调到7左右，再使用低温离心机在18000g 离心力4℃下对混合溶液进行离心分离，取上清液于96孔板用于液相色谱串联质谱上样分析；S14液相色谱分离：利用超高压液相色谱以及相应的流动相，在反向C18分析柱上对4种儿茶酚胺代谢物甲氧基肾上腺素、甲氧基去甲肾上腺素、香草扁桃酸和高香草酸进行分离；S15串联质谱检测：色谱上分离后的甲氧基肾上腺素、甲氧基去甲肾上腺素、香草扁桃酸和高香草酸进入到质谱进行检测，利用三重四级杆质谱中的多重反应监控模式特异性地检测甲氧基肾上腺素、甲氧基去甲肾上腺素、香草扁桃酸和高香草酸，根据不同的色谱洗脱时间，设置不同的检测窗口以及参数；S16校正方程：液相色谱上分离出的甲氧基肾上腺素、甲氧基去甲肾上腺素、香草扁桃酸和高香草酸进入到三重四级杆质谱进行检测，利用三重四级杆质谱中的多重反应监控模式特异性地检测4种儿茶酚胺代谢物甲氧基肾上腺素、甲氧基去甲肾上腺素、香草扁桃酸和高香草酸的含量，根据信号噪音比计算得到定量检测限与鉴定检测限，根据比值以及已知标准品和内标浓度值绘制标准曲线图并得到定量校正方程；S21待测样品处理：取血浆样本，分别加入含内标的乙腈溶液进行蛋白沉淀，充分沉淀后第一次离心，移取血浆上清液并进行冷冻干燥；所述内标为氘代香草扁桃酸和/或氘代甲氧基肾上腺素；S22衍生化反应：避光条件下，利用丹磺酰氯对血浆冻干样品进行衍生化处理使得其与甲氧基肾上腺素、甲氧基去甲肾上腺素、香草扁桃酸和高香草酸发生化学反应；反应完后加入甲酸水溶液调节使pH=7，第二次离心后取样品上清液于96孔板上备用，用于液相色谱串联质谱上样分析；S23液相色谱分离：利用超高压液相色谱以及相应的流动相，在反向C18分析柱上对4种儿茶酚胺代谢物甲氧基肾上腺素、甲氧基去甲肾上腺素、香草扁桃酸和高香草酸进行分离；S24串联质谱检测：色谱上分离后的甲氧基肾上腺素、甲氧基去甲肾上腺素、香草扁桃酸和高香草酸进入到质谱进行检测，利用三重四级杆质谱中的多重反应监控模式特异性地检测甲氧基肾上腺素、甲氧基去甲肾上腺素、香草扁桃酸和高香草酸，根据不同的色谱洗脱时间，设置不同的检测窗口以及参数；S25儿茶酚胺代谢物的含量计算：质谱检测得到甲氧基肾上腺素、甲氧基去甲肾上腺素、香草扁桃酸和高香草酸与内标的比值，将比值代入到定量校正方程，计算得到血浆中甲氧基肾上腺素、甲氧基去甲肾上腺素、香草扁桃酸和高香草酸的含量；所述流动相组成为：A相为20mM醋酸铵和0.1%甲酸水溶液，B相为0.1%甲酸‑乙腈溶液，洗脱梯度为： 时间(min)流速(mL/min)A %B %曲线值1‑0.37525‑230.375251340.3505064100.310906513.50.3109066150.3752511或 时间(min)流速(mL/min)A %B %曲线值1‑0.37525‑21.50.375251330.35050643.50.310906540.310906650.3752511                                                                       。