[发明专利]一种利用石蒜鳞茎愈伤组织产生石蒜碱、力克拉敏的方法

摘要

本发明提供了一种用中国石蒜愈伤组织产生石蒜碱、力克拉敏的方法，以‘中国石蒜’鳞茎为外植体，经消毒、灭菌、接种，培养一段时间后，在鳞片伤口处产生愈伤组织，继续对愈伤组织进行增殖培养。取中国石蒜愈伤组织烘干、研磨并用甲醇超声萃取3次，得到含有石蒜碱、力克拉敏的甲醇溶液。本发明应用组织培养技术克服中国石蒜资源紧张、石蒜碱、力克拉敏化学合成复杂的问题。所用基本培养基以SH培养基为基础，辅以2，4‑二氯苯氧乙酸、L‑脯氨酸、蔗糖等成分；为进行工厂化细胞生产石蒜碱、力克拉敏提供基础，环境友好，原料丰富，可很好缓解市场对石蒜碱、力克拉敏供应缺口大的问题。

主权项

一种利用石蒜鳞茎愈伤组织产生石蒜碱、力克拉敏的方法，其特征是，步骤如下：A、外植体的选择和灭菌处理：以石蒜鳞茎为外植体，2%～3%的洗洁精溶液进行浸泡和冲洗，摇床，再用清水冲洗，经75%酒精杀毒，0.15%氯化汞灭菌处理，无菌水冲洗，备用；B、外植体接种：将经过步骤A中准备的外植体，接种在SH培养基中；C、愈伤组织的诱导：将经过步骤B中得到的外植体，培养于2，4‑D 2.0‑3.0mg/L、 0.5 mg/L BA的SH培养基中，其中蔗糖30g/L，琼脂粉7.5g/L，pH5.80‑5.95，每天光照6‑10 h，黑暗18‑14 h，至出现中国石蒜鳞茎愈伤组织；D、愈伤组织培养： 将步骤C中得到的中国石蒜鳞茎愈伤组织接种于SH+2，4‑D2.0‑3.0 mg/L +L‑脯氨酸100‑300 mg/L的培养基中，培养温度为21±2℃，光照强度为1000‑1600Lux，光照时间为8小时，培养时间为10‑15天；培养10‑15天后检测愈伤组织中石蒜碱、力可拉敏含量；E、石蒜碱、力可拉敏提取：将步骤D中的愈伤组织烘干、研磨并用甲醇超声萃取3次，超声处理时间为25‑35min，得到含有石蒜碱、力克拉敏的甲醇溶液，用0.45μm滤膜过滤，定容至10mL备用；F、石蒜碱、力可拉敏检测：经HPLC检测，石蒜愈伤组织中含有石蒜碱和力可拉敏，平均含量为20.4和19.16 μg/g 干重。