[发明专利]木薯eIF4E3基因RNAi载体沉默效果的检测方法

摘要

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种针对靶标木薯eIF4E3基因的RNAi载体的制备及针对该RNAi载体的较为快捷和简便的沉默效果的检测方法的专利申请。构建载体过程为：首先构建含有反义插入片段的中间载体pRNAiCa4E3R，其次将正义插入片段定向插入，获得含有发夹结构的中间载体pRNAiCa4E3，再将其定向插入表达载体pCAMBIA1300，获得RNAi表达载体p1300‑Ca4E3。本申请同时提供了一种较为快捷、操作较为简便的RNAi载体沉默效果的检测方法。所提供检测方法中，不需常规转基因转化育种制备过程，且可规避原生质体制备困难的缺陷，因而可大幅缩短检测时限，具有较好实用性。

主权项

1.一种靶标木薯eIF4E3基因的RNAi载体，其特征在于，该载体通过如下步骤制备而成：（一）首先，构建中间载体pRNAiCa4E3R，具体为：（1）干扰片段选择选取木薯eIF4E3基因的第305~494 bp为反义插入片段；所述木薯eIF4E3基因序列如SEQ ID NO.1所示，所述木薯eIF4E3基因的第305~494 bp的碱基序列如SEQ ID NO.2所示；（2）设计扩增反义插入片段Ca4E3R的引物具体引物序列为：G‑Ca4E3‑305FE： 5’‑AAACAGCTATGACCATGATTACGAATTCCCTAGTCCCACTGATCTACATCTC‑3’，G‑Ca4E3‑494RC：5’‑AAAAGAAGAAATAAATAATTTAAATATCGATAGTACTGCACCGCATATGTTATCAC‑3’；（3）PCR扩增以pGBKT7‑eIF4E3为模板，利用步骤（2）中所设计引物进行PCR扩增，获得反义插入片段Ca4E3R；（4）构建中间载体pRNAiCa4E3R利用Gibson Assembly技术，将步骤（3）中所获得反义插入片段Ca4E3R与p18TRNAi进行连接，实现将Ca4E3R片段插入到p18TRNAi载体的目的，最终构建获得中间载体pRNAiCa4E3R；（二）其次，构建中间载体pRNAiCa4E3，具体为：（1）干扰片段选择选取木薯eIF4E3基因第266~494 bp为正义插入片段；所述木薯eIF4E3基因第266~494 bp的碱基序列如SEQ ID NO.3所示；（2）设计扩增正义插入片段Ca4E3的引物具体引物序列为：G‑Ca4E3‑266FB：5’‑TGCATGCCTGCAGGTCGACGATTGGATCCGGGTCTGCTATTGCCACTTGGCTC‑3’，G‑Ca4E3‑494RX：5’‑TATGATATCATGCAGGTACGAGCGCTCGAGAGTACTGCACCGCATATGTTATCAC‑3’；（3）PCR扩增以pGBKT7‑eIF4E3为模板，利用步骤（2）中所设计引物进行PCR扩增，获得正义插入片段Ca4E3F；（4）构建中间载体pRNAiCa4E3利用Gibson Assembly技术，将步骤（3）中所获得正义插入片段Ca4E3F与pRNAiCa4E3R进行连接，实现将Ca4E3F片段插入到pRNAiCa4E3R载体的目的，最终构建获得含有发夹结构的中间载体pRNAiCa4E3；（三）构建RNAi载体p1300‑Ca4E3，具体为：将表达载体pCAMBIA1300与步骤（二）中所构建的中间载体pRNAiCa4E3进行酶切并连接，构建获得RNAi表达载体p1300‑Ca4E3。