[发明专利]一种体细胞核移植重组胚注射基因新方法

摘要

本发明公开了一种体细胞核移植重组胚注射基因新方法，该方法包括以下步骤目的基因的制备、体细胞核移植以及显微注射技术。在获取目的基因之后，构建表达载体，利用显微操作去除卵母细胞的细胞核，然后将体细胞注入去核的卵母细胞间隙，再将外源基因直接注入体细胞，通过一步电融合、激活，构建重组胚胎，胚胎移植获取转基因后代。本发明避免大片段的基因转染细胞、筛选，提高了转基因效率，节约时间，扩大了转基因应用范围。需要特别注意的是，在核移植操作过程中，采用透明带下注射体细胞，易于显微注射外源目的基因。

主权项

一种体细胞核移植重组胚注射基因新方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1、目的基因的制备获取目的基因，构建表达载体；步骤2、供体细胞的分离培养从子宫内取出胎儿，含抗生素DPBS清洗胎儿，转移到超净工作台内，用剪刀去除胎儿头，四肢，内脏，DPBS冲洗；在直径100mm细胞培养皿内用剪刀将剩余部分剪碎，组织块大小为1mm3，加入少许血清，将组织块转移到细胞培养瓶的底壁上；用弯头吸管将组织块均匀地铺开，将铺有组织块的一面向上，加入15mL细胞培养液，再放入39℃、相对湿度为100％、体积分数为5％CO2培养箱；待培养6～8h后，将铺有组织块的一面翻转过来，使细胞培养液浸没组织块；培养5d后观察组织块周围有无细胞爬出，待细胞生长至80％汇合时，进行传代培养或者冷冻保存；步骤3、受体细胞的制备猪卵巢从当地屠宰场采集，摘取新鲜卵巢，采用10mL注射器抽吸直径为3～6mm的卵泡，吸取的卵泡液汇集到置于37℃水浴保温的尖底灭菌试管中，静置15～20min，弃上清液，取试管底部卵泡液于表面皿中，实体显微镜下观察，捡取卵丘卵母细胞复合体COCs，转移到DPBS液滴中，冲洗3～5遍，用CO2培养箱内平衡2h以上mTCM199培养基再洗3遍，然后放在39℃，100％湿度，5％CO2培养箱中培养；在0～22h添加10IU/mL PMSG和hCG，后22～44h不加激素；间隔24h调换约1/2～2/3的培养液；COCs培养44h，在4×10倍实体显微镜下观察，将卵丘扩散良好，胞质发育均匀的COCs转移到质量分数为0.1％透明质酸酶溶液中，用移液器轻轻吹打脱去颗粒细胞，以第Ⅰ极体排出作为卵母细胞成熟的主要标准，作为受体细胞；步骤4、显微操作将供体细胞和脱去卵丘的卵母细胞转移到显微操作液滴，39％，5％CO2，100％湿度平衡15min，然后在配有Eppendorf显微操作系统和恒温台的倒置显微镜DM2500Leica上，用固定吸管吸住卵母细胞，将卵母细胞极体调整到“1”点或“5”点钟的位置，用内径25～30μm去核/注射针从“3”点钟处进针，吸取极体和其附近20％～30％的细胞质，选择直径20～30μm，圆形、光滑的供体细胞，从去核切口注入卵周间隙，此时，再将已经构建好外源基因的载体注入到胎儿成纤维细胞内，将重构卵转移到NCSU‑23+4mg/mL BSA中，在39％，5％CO2，100％湿度培养箱中恢复0.5～1h，最后对完整的存活卵进行激活操作；将恢复好的重构卵分批转移到融合液中平衡3min，洗涤3～5遍后，每批5个放入已经铺满融合液，电极宽度为1mm的融合槽中，用自制口吸管使供体细胞‑受体卵细胞膜接触面与电极平行，再用ECM2001融合仪施加60μs、1.2kV/cm，2次直流电脉冲诱导融合并同时激活，之后将经过电击的重构卵用NCSU‑23+4mg/mL BSA洗涤5遍，立即转入矿物油覆盖的胚胎培养液中，在39℃、体积分数为5％CO2及相对湿度为100％条件下培养0.5～1h后判定融合；步骤5、胚胎的培养与移植转基因克隆胚胎体外培养1～2天后，挑选形态和发育较好的胚胎进行移植，自然发情第1或第2天的后备母猪用作受体，受体为二元后备母猪，移植方法为手术法输卵管深部移植，每头受体移植约250枚胚胎；胚胎移植后，对未返情的受体于28～30d，进行超声波妊娠检测，对怀孕母猪，调整饲养管理，直至转基因克隆猪出生。