[发明专利]腐食酪螨新发现过敏原基因克隆表达纯化及其应用

摘要

本发明公开了一种腐食酪螨新发现过敏原Try p 28、Try p 35和Try p 36基因克隆表达纯化方法及其应用，本申请通过采用特定的引物和特定的纯化方法来制备重组蛋白。本发明的方法所得到的纯化产物纯度高，阳性率高，能够作为临床诊断试剂使用，具有广泛的应用前景。

主权项

一种腐食酪螨新发现过敏原Try p 35基因克隆表达纯化方法，其包括如下步骤：1)目的基因获取1.1)引物设计和合成以腐食酪螨Total RNA为模板，RT‑PCR扩增KX060612序列CDS区1461bp克隆至pET28a(+)载体；1.2)反转录和PCR扩增，并使用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0(Code No.9762)切胶回收目的产物，命名为CTG0124‑PCR；2)基因克隆引物设计和合成：名称序列(5′‑3′)长度(mers)CTG0124P1CACTGATGCTCGCCTGGAAG20使用HD Cloning Kit(Clontech Code No.639633)，将CTG0124‑PCR和Vector DNA2连接；热转化至E.coli Competent Cells JM109(Code No.9052)中，涂布平板，37℃过夜培养。使用T7/T7terminator引物挑选阳性菌落植菌，提取阳性克隆质粒CTG0124‑1，并通过验测序验证。3)基因表达与蛋白纯化将质粒CTG0124‑1转入BL21(DE3)T1R感受态细胞中，对阳性克隆进行诱导表达和培养；挑取单菌落至2mL LB/Amp(100μg/mL)培养基中，37℃O/N培养，命名为EXP0212‑2，添加IPTG进行诱导，37℃培养，集菌前吸光度值为2.65；集菌后进行超声波破碎，对菌体破碎液进行离心分离；使用EXP0212‑2甘油菌保进行500mL培养，以从菌体中进行目的蛋白纯化：使用GE HiTrap TALON crude，5mL TALON Superflow柱层析和；使用10倍柱体积的灭菌MilliQ H2O 50mL和10倍柱体积的Buffer A 50mL平衡树脂，流速1mL/min；上样：BufferA平衡化后上样，流速为0.5mL/min；蛋白吸附后，使用10倍体积的Buffer A 50mL清洗树脂，流速1mL/min，W1：10mL，W2：20mL，W3：20mL；蛋白溶出Elution：Buffer A 50mL、Buffer B 50mL梯度溶出，流速1mL/min，Fraction 1.1mL/tube×90tubes；收集目的蛋白Fraction No.46～90，使用Nanodrop‑100进行定量分析，获得纯化重组蛋白，蛋白纯度为99％。