[发明专利]一种下调真核基因表达的方法及其试剂盒

摘要

本发明公开了一种下调真核基因表达的方法及其试剂盒，采用5’‑磷酸化单链寡聚脱氧核糖核苷酸(5’‑p‑ss‑DNA Oligo)和Argonaute mRNA联合下调基因表达，包括NgAgo基因的改造，表达质粒的构建，表达质粒经过线性化、体外转录、回收步骤获得Argonaute mRNA，根据目的基因序列设计并合成5’‑p‑ss‑DNA Oligo，将Argonaute mRNA和5’‑p‑ss‑DNA Oligo导入靶细胞中等步骤；本发明所述的方法中改造的NgAgo基因能够在靶细胞中快速高效的进入细胞核；5’‑p‑ss‑DNA Oligo序列依据目的基因设计，对靶序列识别具有良好的特异性；5’‑p‑ss‑DNA Oligo/NgAgo系统通过对真核细胞DNA水平的抑制作用，能够稳定高效的下调目的基因表达；5’‑p‑ss‑DNA Oligo具有良好的稳定性，利于在细胞内发挥作用；真核细胞自然条件下不存在内源性的5’‑p‑ss‑DNA Oligo因此特异性高。

主权项

一种下调真核基因表达的方法，其特征在于，包括如下几个步骤：1)NgAgo基因的改造：在NgAgo基因序列末端引入一个或两个核定位序列，并在其3’端加入polyA、在5’端加入5’‑UTR序列和启动子SP6/T7/T3序列，改造的NgAgo基因的序列为SEQ.ID.NO.1；2)表达质粒的构建：改造的NgAgo基因序列和载体分别进行双酶切获取粘性末端的DNA序列、然后对DNA序列进行纯化回收，连接酶催化DNA序列并纯化回收获得表达质粒；3)表达质粒经过线性化、体外转录、回收步骤获得Argonaute mRNA；4)根据目的基因序列设计并合成5’‑p‑ss‑DNA Oligo；5)将Argonaute mRNA和5’‑p‑ss‑DNA Oligo导入靶细胞中；6)培养靶细胞至一定时间，观察细胞形态，通过PCR扩增目的基因，通过Sanger基因测序技术验证目的基因的突变情况，通过qRT‑PCR检测目的基因的表达水平。