[发明专利]一种基于老年痴呆症的尿液代谢标志物鉴定方法

摘要

一种基于老年痴呆症的尿液代谢标志物鉴定方法，本发明涉及基于老年痴呆症的尿液代谢标志物鉴定方法。本发明的目的是为了解决现有老年痴呆症的尿液代谢标志物尚未阐明的缺点。一种基于老年痴呆症的尿液代谢标志物鉴定方法具体过程为：步骤一、老年痴呆大鼠模型的建立及评价；步骤二、利用生物标记物评价开心散对AD大鼠模型建立不同阶段的干预作用。本发明用于代谢标志物鉴定领域。

主权项

1.一种基于老年痴呆症的尿液代谢标志物鉴定方法，其特征在于：一种基于老年痴呆症的尿液代谢标志物鉴定方法具体过程为：步骤一、老年痴呆大鼠模型的建立及评价；步骤一一、利用腹腔注射D‑半乳糖联合灌胃三氯化铝诱导大鼠，建立AD大鼠模型；步骤一二、利用行为学、组织病理学及临床生化指标评价AD大鼠模型的建立过程；步骤二、利用生物标记物评价开心散对AD大鼠模型建立不同阶段的干预作用；步骤二一、制备开心散冻干粉和开心散灌胃溶液，得到体内含有开心散的大鼠；步骤二二、对空白组大鼠和D大鼠模型进行分组及设计；步骤二三、根据步骤二二对空白组大鼠和AD大鼠模型进行尿液样品采集及前处理，得到滤液；步骤二四、对步骤二三得到的滤液经UPLC‑MS分析处理，鉴定潜在的生物标记物；步骤二五、对步骤二四鉴定的潜在生物标记物进行潜在生物标记物的筛选、鉴定及开心散对AD大鼠模型建立不同阶段大鼠尿液生物标记物的影响；所述步骤一一中利用腹腔注射D‑半乳糖联合灌胃三氯化铝诱导大鼠，建立AD大鼠模型；具体过程为：利用灌胃氯化铝联合腹腔注射D‑半乳糖的方法诱导大鼠，诱导大鼠第15天大鼠进入轻度认知障碍前期，诱导大鼠第45天大鼠进入轻度认知障碍期，造模第60天进入轻度认知障碍中期，诱导大鼠第90天大鼠进入痴呆期，得到AD大鼠模型；所述步骤二一中制备开心散冻干粉和开心散灌胃溶液，得到体内含有开心散的大鼠；具体过程为：步骤二一一、开心散冻干粉的制备；药材粗粉按质量份数比为：人参：茯苓：远志：石菖蒲＝3:3:2:2，称取500g药材粗粉，混匀，用6倍量的质量浓度为70％乙醇加热回流提取2次，每次2h，合并滤液，浓缩，并用冷冻干燥法干燥，得疏松粉末，密封置于干燥器中备用并计算出粉率，出粉率为23.4％；以4粒准1g计算，每人每天给生药量21粒＝5g/天，大鼠等倍给药量为5g×0.018/0.2kg＝0.45g/kg；步骤二一二、开心散灌胃溶液的制备；取开心散冻干粉，溶于蒸馏水中，配制成生药浓度为0.54g/mL的开心散灌胃溶液，大鼠灌胃10mL/kg体重；所述步骤二三中根据步骤二二对空白组大鼠和AD大鼠模型进行尿液样品采集及前处理，得到滤液；具体过程为：AD大鼠模型建立第15天、第45天、第60天、第90天晚8:00将AD大鼠模型和空白组大鼠于置于大鼠代谢笼中，次日早8:00收集夜尿；对收集得到的尿液样品于4℃，13 000rpm离心15min后取上层清液，蒸馏水稀释一倍，混悬振荡30s后，0.22μm微孔滤膜过滤，得到滤液；所述步骤二四中对步骤二三得到的滤液经UPLC‑MS分析处理，鉴定潜在的生物标记物；具体过程为：滤液经UPLC‑MS分析得到代谢指纹图谱，代谢指纹图谱数据采用WatersQI软件进行预处理，对预处理后的每个检测峰的离子强度进行标准化处理，然后将峰面积、样品名称和离子强度组成的数据导入EZinfo2.0进行多维模式识别分析，鉴定潜在的生物标记物；AD大鼠模型建立过程第15天尿液中共鉴定出35个潜在的生物标记物；第45天尿液中共鉴定出48个潜在的生物标记物；第60天尿液中共鉴定出40个潜在的生物标记物；第90天尿液中共鉴定出42个潜在的生物标记物；其中，第15天及45天重叠标记物10个，15天与60天重叠标记物3个，15天与90天重叠标记物8个，45天与60天共重叠标记物13个，45天与90天重叠标记物16个，60天与90天重叠标记物11个，顺‑4‑癸烯酸为从AD大鼠模型建立的起始阶段就出现直至痴呆期的标记物；色谱分析条件为：色谱仪：Acquity^TM UPLC液相色谱仪；色谱柱：ACQUITY UPLC^TM HSS T3 column；流动相：流动相A为0.1％甲酸乙腈，流动相B为0.1％甲酸水；柱温预设：45℃；样品仓温度预设：4℃；流速：0.4mL/min；进样体积：2μL；色谱仪流出液不经分流直接注入质谱仪进行正负离子扫描分析；梯度洗脱程序为：初始时刻，流速为0.4mL/min，1％流动相A，99％流动相B，无洗脱曲线；洗脱时间为2.5min时，流速为0.4mL/min，11％流动相A，89％流动相B，洗脱曲线为6；洗脱时间为4.5min时，流速为0.4mL/min，21％流动相A，79％流动相B，洗脱曲线为7；洗脱时间为7min时，流速为0.4mL/min，40％流动相A，60％流动相B，洗脱曲线为6；洗脱时间为8.5min时，流速为0.4mL/min，99％流动相A，1％流动相B，洗脱曲线为6；洗脱时间为10.5min时，流速为0.4mL/min，99％流动相A，1％流动相B，洗脱曲线为6；洗脱时间为10.6min时，流速为0.4mL/min，1％流动相A，99％流动相B，洗脱曲线为6；洗脱时间为13min时，流速为0.4mL/min，1％流动相A，99％流动相B，洗脱曲线为6；质谱分析条件正离子扫描模式：电喷雾离子源：采用Synapt^TM G2‑Si质谱分析系统；脱溶剂气流量：800L/h；脱溶剂气温度：450℃；锥孔反吹气流量：50L/h；离子源温度：110℃；锥孔电压：20V；毛细管电压：3.0kV；锁定质量溶液：采用美国Waters公司Lockspray校正系统进行在线质量校正，亮氨酸‑脑啡肽，溶液浓度为1ng/μL，流速为5μL/min；质量扫描范围：m/z50‑1000Da，扫描时间0.2s；以centriod模式进行数据采集；工作站：MassLynx V4.1工作站；负离子扫描模式：脱溶剂气流量：800L/h；脱溶剂气温度：450℃；锥孔反吹气流量：50L/h；离子源温度：110℃；锥孔电压：20V；毛细管电压：3.0kV；锁定质量溶液：采用美国Waters公司Lockspray校正系统进行在线质量校正，亮氨酸‑脑啡肽，溶液浓度为1ng/μL，流速为5μL/min；其余参数条件同正离子扫描模式；所述步骤二五中对步骤二四鉴定的潜在生物标记物进行潜在生物标记物的筛选、鉴定及开心散对AD大鼠模型建立不同阶段大鼠尿液生物标记物的影响；步骤二五一、筛选出潜在生物标记物；对各不同时期AD大鼠模型组大鼠与空白组大鼠尿液代谢轮廓数据进行OPLS‑DA分析，对各组所获得信息数据进行统计学分析，比较AD模型组和空白组各离子含量差别是否具有统计学意义，基于P<0.05作为筛查条件，筛选出差异离子作为潜在生物标记物集合；步骤二五二、对潜在生物标记物进行鉴定；步骤二五三、根据步骤二五一和步骤二五二确定开心散对AD大鼠模型建立不同阶段大鼠尿液生物标记物的影响；所述步骤二五三中根据步骤二五一和步骤二五二确定开心散对AD大鼠模型建立不同阶段大鼠尿液生物标记物的影响；具体过程为：AD大鼠模型建立过程第15天尿液中共鉴定出35个潜在的生物标记物，与空白组比较，标记物含量上升的有20个，含量下降的有15个；AD大鼠模型建立过程第45天尿液中共鉴定出48个潜在的生物标记物，与空白组比较，标记物含量上升的21个，含量下降的有27个；AD大鼠模型建立过程第60天尿液中共鉴定出40个潜在的生物标记物，与空白组比较，标记物含量上升的有22个，含量显著下降的有18个；AD大鼠模型建立过程第90天尿液中共鉴定出42个潜在的生物标记物，与空白组比较，标记物含量上升的有18个，含量下降的有24个；开心散对AD大鼠模型建立的第15天大鼠尿液生物标记物的影响的过程为：在D‑gal联合AlCl₃诱导的AD大鼠模型建立过程第15天尿液的35个潜在的生物标记物中，开心散对其中31个具有调节作用，7个具有统计学意义，包括3‑甲基二氧吲哚，苏氨脯氨酸，N‑乙酰基‑4‑O‑乙酰神经氨酸，咪唑丙酸，3‑羟癸二酸，色氨酸，甲硫蛋氨酸；开心散对AD大鼠模型建立的第45天大鼠尿液生物标记物的影响的过程为：AD大鼠模型建立第45天尿液中共鉴定出48个潜在的生物标记物，开心散对其中34个具有调节作用，21个具有统计学意义，包括甲酰邻氨基苯甲酸，十二碳二元酸，2‑甲基马尿酸，异高香草酸，5‑甲氧色醇，褪黑素，香草丙酮酸，4‑羟基‑5‑苯基‑戊酸‑O‑葡萄糖苷酸，邻苯三酚‑2‑O‑葡萄糖苷酸，高柠檬酸，二甲基精氨酸，3,4‑二羟基苯基乙醛，酪氨酸，肉碱，酪氨酸胺，5‑羟色醇，4‑(2‑氨基苯基)‑2，4‑二氧丁酸，犬尿胺，犬尿酸，2‑羟癸酸，色氨酸；开心散对AD大鼠模型建立第60天大鼠尿液生物标记物的影响；AD大鼠模型建立第60天尿液中共鉴定出40个潜在的生物标记物，开心散对其中29个具有调节作用，9个具有统计学意义，包括3,4‑二羟苯基乙醛，4,6‑二羟基喹啉，羟脯氨酰基‑异亮氨酸，2‑辛烯酸‑10‑羟‑9‑十八碳酯，二甲基精氨酸，4‑羧苯基甘氨酸，丙二酰肉碱，3‑甲氧基酪氨酸；开心散对AD大鼠模型建立第90天大鼠尿液生物标记物的影响；AD大鼠模型建立第90天尿液中共鉴定出42个潜在的生物标记物，开心散对其中22个具有调节作用，7个具有统计学意义，包括羟脯氨酰基组氨酸，2‑异丙基苹果酸，4,6‑二羟喹啉，十二烷二酸，3‑甲基二氧吲哚，2‑辛烯酸，肾上腺乙醇酰胺；分析开心散对各阶段标记物的调节情况，其中第15天及45天重叠标记物6个，15天与60天重叠标记物3个，15天与90天重叠标记物5个，45天与60天共重叠标记物10个，45天与90天重叠标记物5个，60天与90天重叠标记物6个。