[发明专利]冠心病尿液代谢标记物的鉴定及分析方法

摘要

冠心病尿液代谢标记物的鉴定及分析方法，本发明涉及尿液代谢标记物的鉴定及分析方法。本发明为了解决现有检测冠心病的方法效率低、费用高以及不能早发现、早治疗的问题。本发明步骤为：一：尿液样品的采集及预处理；二：尿液样品的制备；三：进行UPLC分离；四：将UPLC分离后的尿液样品不经分流直接注入质谱仪进行正负离子扫描分析；五：进行尿液代谢生物标记物的鉴定，得到39个潜在尿液生物标记物；六：对39个潜在尿液生物标记物进行代谢通路分析，得到19个代谢通路；七：采用ROC曲线分析，根据AUC的大小，进一步确定与冠心病相关的生物标记物。本发明应用于代谢标记物鉴定领域。

主权项

1.冠心病尿液代谢标记物的鉴定及分析方法，其特征在于，所述鉴定及分析方法包括以下步骤：步骤一：尿液样品的采集及预处理；步骤二：尿液样品的制备；步骤三：将步骤二制备的尿液样品进行UPLC分离；步骤四：将步骤三中UPLC分离后的尿液样品不经分流直接注入质谱仪进行正负离子扫描分析；步骤五：根据步骤四进行尿液代谢生物标记物的鉴定，得到39个潜在尿液生物标记物；步骤六：对步骤五得到的39个潜在尿液生物标记物进行代谢通路分析，得到20个代谢通路；步骤七：采用ROC曲线分析，根据AUC的大小，进一步确定与冠心病相关的生物标记物；所述步骤一中尿液样品的采集及预处理的具体过程为：每天收集受试者首次空腹晨尿和夜间睡前最后一次尿液，连续收集3天；尿液于12000～13000rpm，4℃离心8～10min，取上清液，置‑20℃冰箱中保存；样品冻藏前从每个样品中移取1ml分装，其余整体冷冻密封保存；所述步骤二中尿液样品的制备的具体过程为：取解冻的尿液在12000～13000rpm，4℃条件下离心8～10min，取上清液，加入蒸馏水稀释，振荡1min，经0.22μm滤膜过滤；所述步骤三中UPLC条件为：色谱柱：Waters AcquityTM UPLC HSS T3，规格为2.1mm×100mm，1.8μm；流动相A为0.1％甲酸‑乙腈，B为0.1％甲酸‑水；色谱柱温度为40℃；样品仓温度为4℃；流速为0.40mL/min～0.60mL/min；所述步骤四中进行正负离子扫描分析的质谱条件为：正离子扫描模式：锥孔电压为20v，毛细管电压为3kv，离子源温度为110℃，脱溶剂气温度为350℃，脱溶剂气流量为1000L/h，锥孔反吹气流量为50L/h，扫描范围为m/z50‑1200Da，以centriod模式进行数据采集，锁定质量溶液采用亮氨酸‑脑啡肽溶液；负离子扫描模式：锥孔电压为20v，毛细管电压为3kv，离子源温度为110℃，脱溶剂气温度为350℃，脱溶剂气流量为800L/h，锥孔反吹气流量为50L/h，扫描范围为m/z50‑1200Da，以centriod模式进行数据采集，锁定质量溶液采用亮氨酸‑脑啡肽溶液；所述步骤五中39个潜在尿液生物标记物具体为：采用SPSS17.0进行统计分析，共鉴定了39个潜在尿液生物标记物，包括半乳糖酸，肌酐，二甲基‑L‑精氨酸，乳糖苷，胸腺嘧啶，2‑糠酸，磷酸二乙酯，尿刊酸，L‑乙酰，UDP‑4脱氢‑6‑脱氧‑D‑葡萄糖，尿酸，柠檬酸，二磷酸鸟苷，7‑甲基腺嘌呤，衣康酸，O型磷酸‑4‑羟基‑L‑苏氨酸，N1甲基‑4‑吡啶酮‑3‑甲酰胺，1‑甲基鸟嘌呤，7‑氨基甲基‑7‑卡巴鸟嘌呤，5‑磺基水杨酸，多巴胺‑4‑硫酸，6‑羟基‑5‑甲氧基吲哚葡糖苷酸，高香草酸硫酸，乙酰基‑N‑甲酰基‑5‑甲基犬尿氨酸，L‑谷氨酰胺，间甲酚，多巴醌，吲哚乙酸，壳二糖，壬二酸，对甲苯乙基，L‑肉碱辛，21羟基5B‑孕3,11,20三酮，11‑氧代雄甾酮葡糖苷酸，2‑苯基葡糖苷酸，辅酶‑1，醇酮葡萄糖醛酸，芥子醇，单乙基己基邻苯二甲酸；所述步骤六中得到20个代谢通路具体为：将鉴定得到的39个冠心病尿液潜在生物标记物进行MetPA分析，20个代谢通路，包括半乳糖代谢，丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代谢，酪氨酸代谢，组氨酸代谢，柠檬酸循环，嘧啶代谢，维生素B6代谢，D‑谷氨酰胺和D‑谷氨酸代谢，类固醇激素生物合成，氨基糖和核苷酸糖代谢，淀粉和蔗糖代谢，嘌呤代谢，戊糖和葡糖醛酸互变，精氨酸和脯氨酸代谢，乙醛酸和二羧酸代谢，色氨酸代谢，氮代谢，烟碱和烟酰胺代谢，氨酰‑tRNA生物合成。