[发明专利]一种基于硅溶胶密度梯度离心检测种子携带细菌的方法

摘要

本发明公开一种基于硅溶胶密度梯度离心检测种子携带细菌的方法。该方法包括：待检水稻种子的准备、Ludox HS40等渗母液配制、不连续密度Ludox HS40分离工作液配制、在离心管中铺设不连续密度Ludox HS40分离工作液、离心、用1×TE缓冲液悬浮沉淀、种子携带细菌PCR扩增、16S rDNA克隆文库的构建、16S rDNA克隆文库评价、细菌种类分析。本发明利用硅溶胶在离心管中铺设的不连续密度Ludox HS40分离工作液及参数，能分离纯化尽可能多的细菌，提高了检测的准确性，能反映所检测批次种子携带细菌的多样性水平，克服了现有检测技术中分离细菌种类少，不能完全反应种子所携带细菌的缺陷。

主权项

1.一种基于硅溶胶密度梯度离心检测种子携带细菌的方法,其特征在于包括以下步骤：(1)待检水稻种子的准备取待检水稻种子50粒，先用200mL灭菌水清洗待检水稻种子1～2次后，依次用70％乙醇2.5mL浸泡2～3min，2.5％的次氯酸钠2.5mL浸泡3～5min，70％乙醇2.5mL浸泡20s～30s，接着用灭菌水冲洗种子3～4次，将种子晾干后在灭菌研钵中磨碎，用50目筛子过滤，取50目筛子下面的磨碎水稻种子再用100目筛子过滤，取100目筛子下面的磨碎水稻种子置于直径为9cm的灭菌培养皿中备用；(2)Ludox HS40等渗母液的配制用10×PBS缓冲液与Ludox HS40硅溶胶按照1︰9体积比的比率混合制成Ludox HS40等渗母液，Ludox HS40等渗母液密度为1.308g/mL；(3)配制不连续密度Ludox HS40分离工作液按如下方法配制1#Ludox HS40分离工作液、2#Ludox HS40分离工作液、3#Ludox HS40分离工作液；1#Ludox HS40分离工作液的配制：用10×PBS缓冲液1mL与9mL Ludox HS40等渗母液混合配制成的溶液即为1#Ludox HS40分离工作液，1#Ludox HS40分离工作液密度为1.108g/mL；2#Ludox HS40分离工作液的配制：用10×PBS缓冲液4mL与6mL Ludox HS40等渗母液混合配制成的溶液即为2#Ludox HS40分离工作液，2#Ludox HS40分离工作液密度为1.082g/mL；3#Ludox HS40分离工作液的配制：用10×PBS缓冲液6mL与4mL Ludox HS40等渗母液混合配制成的溶液即为3#Ludox HS40分离工作液，3#Ludox HS40分离工作液密度为1.042g/mL；(4)在离心管中铺设不连续密度Ludox HS40分离工作液在10mL灭菌离心管中，用移液器先铺设1#Ludox HS40分离工作液2mL，然后铺设2#Ludox HS40分离工作液2mL，最后铺设3#Ludox HS40分离工作液2mL，铺设完毕后，将离心管置于试管架上，不能晃动；(5)离心①取步骤(1)在灭菌培养皿中储备的磨碎水稻种子1.00g，置于10mL灭菌离心管中，再加入1×HEPES缓冲液8mL，在涡旋振荡器上混匀5min，室温放置5h后，取上清液在湘仪H1850R离心机上离心20min，离心条件为：3号转子，4℃，10000rpm，加速度值设为5，刹车值设为5；②离心后，弃上清，沉淀用1×HEPES缓冲液1mL悬浮得悬浮液，取悬浮液300μL铺设于步骤(4)铺设有不连续密度Ludox HS40分离工作液的离心管中的溶液表面，每个样品检测做8次重复，铺设好后，在湘仪H1850R离心机上离心15min，离心条件为：3号转子，4℃，8500rpm，加速度值设为2，刹车值设为0，形成密度梯度分离层后，将离心管取出，用移液器吸取1#Ludox HS40分离工作液与2#Ludox HS40分离工作液之间的絮状界面层溶液；(6)用1×TE缓冲液悬浮沉淀将吸取的絮状界面层溶液装入新的离心管中，加入500μL10×PBS缓冲液，混匀后，3000rpm离心2min，弃上清去除Ludox HS40，沉淀用1×TE缓冲液悬浮得1×TE悬浮液；(7)种子携带细菌PCR扩增以步骤(6)获得的1×TE悬浮液为总DNA模板，用上游引物799F和下游引物1492R进行PCR扩增，总体积为50μL的PCR反应体系为：DNA模板2μL，1×Taq reaction 5μL，10nM/μL上游引物799F 2μL，10nM/μL下游引物1492R 2μL，1U/μL Taq酶2μL，2.5M/μL dNTPs 4μL，ddH₂O 33μL；反应程序：94℃预变性5min，从94℃变性1min，52℃退火1min至72℃延伸1min，30个循环后，72℃延伸10min，4℃保存；PCR产物大小为750bp；所述上游引物799F的碱基序列如SEQ ID NO：1所示，下游引物1492R的碱基序列如SEQ ID NO：2所示；(8)16S rDNA克隆文库的构建将扩增得到的PCR产物在1％的琼脂糖凝胶中电泳，电泳完毕后，在紫外灯下切取700～800bp条带，回收750bp条带，用T载体进行连接后转化JM109感受态细胞得到转化子，再加入SOC培养基培养，将培养后的SOC培养基涂到含有氨苄、IPTG和X‑Gal的LB平板培养基上，待菌落长出后，随机挑取160个以上的白色菌落测序；(9)16S rDNA克隆文库评价按计算公式：C＝(1‑n1/N)×100％，其中n1为只含有一条序列的OTU的数目；N为随机挑取的所有白色菌落中出现的总的序列数目，并使用QIIME软件进行C值计算，C值为95％以上，按如下步骤(10)进行细菌种类分析；(10)细菌种类分析将步骤(8)的测序结果在NCBI上发布的16S rDNA序列进行序列比对确定细菌种类，经比对，序列相似性为97％以上的归为同一细菌种类。