[发明专利]一种漆酶的修饰方法

摘要

本发明属于生物漆酶修饰改性技术领域，涉及一种同时提高漆酶(laccase)催化活性和稳定性的修饰方法，利用聚丙烯酸(PAA)能同时固定铜离子和酶，聚(乙二醇)甲基醚丙烯酸酯(PEGA)能提高漆酶的稳定性的原理，通过RAFT(可逆加成断裂链转移)聚合合成嵌段共聚物PAA/PPEGA,然后将制备的共聚物PAA/PPEGA与铜离子结合来提高漆酶活性，实现修饰后漆酶的催化活性和稳定性的显著提高，该方法操作步骤简单，所需化学药品加入量少，所需反应条件温和，制备效率高，制备的漆酶固定到大面积的石墨烯纸上后，能够实现漆酶在降解邻苯二酚污染物中的重复利用。

主权项

1.一种漆酶的修饰方法，其特征在于具体工艺包括如下步骤：一、通过可逆加成断裂链转移聚合合成嵌段共聚1物聚丙烯酸/聚(聚(乙二醇)甲基醚丙烯酸酯):(1)、将20‑60mg可逆加成断裂链转移试剂、2‑10mg偶氮二异丁腈、0.2‑0.5g丙烯酸，在圆底烧瓶中用2‑5mL超纯水和3‑7mL二氧六环溶解，将圆底烧瓶用橡胶塞密封，通入氮气30‑60分钟以除去圆底烧瓶中的氧气，再将圆底烧瓶油浴在20‑90℃下加热，磁力搅拌反应5‑36小时；(2)、打开步骤(1)中圆底烧瓶并加入1‑5g聚(乙二醇)甲基醚丙烯酸酯，将圆底烧瓶用橡胶塞密封，通入氮气10‑60分钟，然后在30‑150℃下油浴，磁力搅拌反应10‑24小时，将反应制得的混合物用乙醚沉淀1‑6次，得到的沉淀物即为聚丙烯酸/聚(聚(乙二醇)甲基醚丙烯酸酯),将制得的沉淀物置于烘箱中，在20‑70℃下干燥24‑48小时至恒重，储存备用；二、用聚丙烯酸/聚(聚(乙二醇)甲基醚丙烯酸酯)对漆酶进行修饰：(1)、将0.3‑0.6g聚丙烯酸/聚(聚(乙二醇)甲基醚丙烯酸酯)、7‑11mg 1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐在50mL的圆底烧瓶中用15‑25ml二氯甲烷溶解，室温下搅拌反应20‑70分钟；(2)、在步骤(1)制得的试剂中加入4‑9g N‑羟基琥珀酰亚胺,室温下反应24小时，用乙醚沉淀三次，制得活化的聚合物聚丙烯酸/聚(聚(乙二醇)甲基醚丙烯酸酯)‑N‑羟基琥珀酰亚胺,再将制得的聚丙烯酸/聚(聚(乙二醇)甲基醚丙烯酸酯)‑N‑羟基琥珀酰亚胺置于烘箱中，在25‑80℃下干燥24‑72小时至恒重备用；(3)、配制浓度为0.1‑0.9mol/L，pH＝5‑9的醋酸盐缓冲液,称取10‑60mg原漆酶溶于20mL醋酸盐缓冲液中配制0.5‑3mg/mL的原漆酶储备液备用，称取100‑400mg聚丙烯酸/聚(聚(乙二醇)甲基醚丙烯酸酯)‑N‑羟基琥珀酰亚胺，溶于10mL醋酸盐缓冲液中配制10‑40mg/mL的聚丙烯酸/聚(聚(乙二醇)甲基醚丙烯酸酯)‑N‑羟基琥珀酰亚胺储备液备用；(4)、取10‑15mL步骤(3)制备的漆酶储备液逐滴加入到搅拌的0.5‑11mL聚丙烯酸/聚(聚(乙二醇)甲基醚丙烯酸酯)‑N‑羟基琥珀酰亚胺的储备液中，将上述制得的溶液在冰浴下搅拌反应4‑12小时，然后用截留分子量为20000‑50000的透析膜冰浴透析1‑3天，用以除去过量的聚丙烯酸/聚(聚(乙二醇)甲基醚丙烯酸酯)‑N‑羟基琥珀酰亚胺，制得用聚丙烯酸/聚(聚(乙二醇)甲基醚丙烯酸酯)修饰后的漆酶；三、用铜离子对用聚丙烯酸/聚(聚(乙二醇)甲基醚丙烯酸酯)修饰后的漆酶进行修饰：(1)、用醋酸盐缓冲液配制8‑20mmol/l的硫酸铜溶液，然后将步骤二中制得的用聚丙烯酸/聚(聚(乙二醇)甲基醚丙烯酸酯)修饰后的漆酶在硫酸铜溶液中于0‑37℃下培养10‑20小时，制得聚丙烯酸/聚(聚(乙二醇)甲基醚丙烯酸酯)和铜离子修饰后的漆酶的混合溶液；(2)、将步骤(1)中制得的混合试剂利用截留分子量为500‑1000的透析膜冰浴中透析，除去吸附不牢的铜离子，制得聚丙烯酸/聚(聚(乙二醇)甲基醚丙烯酸酯)和铜离子修饰后的漆酶，并冷冻干燥条件下存储。