[发明专利]一种分子改造手段提高酿酒酵母的乙醇耐受性的方法有效
| 申请号： | 201610958650.6 | 申请日： | 2016-10-28 |
| 公开（公告）号： | CN106399351B | 公开（公告）日： | 2019-12-13 |
| 发明（设计）人： | 李倩;王亮;韦光绪;余雅娴;代青川;宋海锋;刘欢;杨东春 | 申请（专利权）人： | 大连大学 |
| 主分类号： | C12N15/81 | 分类号： | C12N15/81;C12N1/19;C12R1/645 |
| 代理公司： | 21235 大连智高专利事务所(特殊普通合伙) | 代理人： | 胡景波 |
| 地址： | 116622 辽宁省*** | 国省代码： | 辽宁;21 |
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| 摘要： | 本发明提供一种分子改造手段提高酿酒酵母乙醇耐受性的方法，该方法为：建立RHO1基因的突变序列文库，导入酿酒酵母，通过添加乙醇的平板筛选方法获得耐受性提高的菌株。本发明利用小GTP水解酶从调节细胞形态入手进而提高细胞乙醇胁迫耐受响应，采用类似全局转录调控的方法对小GTP水解酶进行随机突变，通过主动干预细胞形态来达到调节细胞乙醇耐受性的目的。通过本发明方法可有效筛选到乙醇耐受性提高的菌株，构建的载体有普遍适用性，可适用于实验室酵母、工业酵母。 | ||
| 搜索关键词： | 一种 分子 改造 手段 提高 酿酒 酵母 乙醇 耐受 方法 | ||
【主权项】：
1.一种分子改造手段提高酿酒酵母乙醇耐受性的方法，其特征在于，适用于工业酿酒酵母或实验室模式菌株，具体包括以下步骤：/nS1.基因组选取；/nS2.以PGK-F/R为引物PCR扩增对应宿主PGK1启动子片段，以BamHI和EcoRI双酶切、回收后，连入经BamHI和EcoRI双酶切线性化的pRS316载体，转化E.coli DH5α构建载体pRS316-PGK01；/nPGK-F：TTGGATCCACTGTAATTGCTTTTAGTTG/nPGK-R：CCAGAATTCTGTTTTATATTTGTTGTAAAAAG/nS3.以基因组为模板，用引物对RHO-F/R利用易错PCR扩增RHO1基因，克隆得到的片段纯化后与载体pRS316-PGK01分别进行双酶切、进行连接反应，建立突变序列文库，得突变载体；/nRHO-F：CGTGAATTCATGTCACAACAAGTTGGTAACAG/nRHO-R：CTCGGTACCCTATAACAAGACACACTTCTTCT/nS4.将突变载体转入酿酒酵母，涂布于5-12％(v/v)乙醇的平板上，筛选得到耐受性高的菌株；乙醇平板培养条件具体为：30℃培养48h，挑选可以正常生长的菌落，进行耐受性评价，筛选得耐受性高的菌株。/n
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