[发明专利]一种大薯类原球茎的超低温保存及恢复培养方法

摘要

本发明涉及一种大薯类原球茎超低温保存及恢复培养方法，属于植物细胞工程领域。超低温保存步骤有：无菌苗诱导及继代培养，类原球茎诱导，梯度驯化培养，剥取类原球茎及固定到装载条，然后置放于预处理溶液处理，转入玻璃化保护剂中冰浴处理，再迅速投入液氮中保存。恢复培养步骤有：从液氮中取出带类原球茎的装载条，放入1/2MS液体培养基中解冻并洗涤，用滤纸吸干后置于不含激素1/2MS培养基中暗培养，在解剖镜下将类原球茎逐一由装载条剥离，转移到含BA及GA3的培养基上进行暗培养，再生后转入含BA及NAA的培养基中光照培养。其有益效果是，通过类原球茎为材料超低温保存大薯资源可获得大量可供保存及容易再生的材料。

主权项

一种大薯类原球茎的超低温保存方法，其特征在于，所述超低温保存方法包括如下步骤：步骤a: 取继代3个月以上的大薯无菌组培苗，切取上部约1cm左右带腋芽的茎段，接种到含BA1mol·L‑1，NAA0.2mol·L‑1，GA30.5molL‑1的MS培养基中，黑暗中培养8‑10天后，获得诱导类原球茎；步骤b:取步骤a获取的诱导类原球茎的茎段转入到含氯化钙0.1mol·L‑1、蔗糖0.3mol·L‑1、脱落酸0.5‑5mg·L‑1的培养基上培养3‑7天；步骤c:取经过步骤b处理的茎段转入到含氯化钙0.1mol·L‑1、蔗糖0.7mol·L‑1、脱落酸0.5‑5mg·L‑1的培养基上黑暗中预培养16小时；步骤d:经过步骤c处理的茎段置于解剖镜下，剥取2‑3mm类原球茎，用镊子将类原球茎在含2‑4%的无钙离子海藻酸钠溶液中轻蘸，然后置放在5mm×20mm金属网状装载条上，其中，每条装载条上有5‑10个类原球茎；步骤e:将带类原球茎的装载条浸入含有0.1‑0.3%氯化钙、0.4mol·L‑1蔗糖和2mol·L‑1甘油的MS液体培养基中，经10‑30min固定后，将装载条在无菌滤纸上吸去多余液体步骤f: 将步骤e固定的带类原球茎的装载条放入预处理溶液中，于室温下处理120‑180min后，然后转入玻璃化保护剂PVS2中进行60‑90min的冰浴处理，然后将带类原球茎的装载条迅速投入液氮中保存。