[发明专利]一种海伦兜兰愈伤组织再生体系快速繁殖方法

摘要

本发明公开了一种海伦兜兰愈伤组织再生体系快速繁殖方法。本发明在对刚冒出分蘖芽的海伦兜兰进行一系列药剂处理及培养获得茎节拉长的分蘖芽，以分蘖芽的茎节为外植体，采用独特的培养基进行愈伤组织的诱导和增殖、类原球茎的诱导和增殖、类原球茎的分化和生根壮苗培养获得优质种苗的愈伤组织再生体系快速繁殖方法，能生产出大量的种苗供应市场并应用于迁地保护和自然回归，有利于海伦兜兰的资源保护和可持续利用。

主权项

1.一种海伦兜兰愈伤组织再生体系快速繁殖方法，其特征在于，包括以下步骤：a、愈伤组织的诱导和增殖：取海伦兜兰(Paphiopedilum helenaeAver.)的分蘖芽，切除叶片后进行消毒处理，将其切成带一个节的茎段，得到消毒后的外植体，然后将外植体接种到诱导培养基中培养，培养温度24℃～30℃，光照度1500～2000勒克斯，光照时间12～16小时/天，获得愈伤组织，然后将愈伤组织转移到增殖培养基上进行增殖培养，培养温度24℃～30℃，光照度1500～2000勒克斯，光照时间12～16小时/天，愈伤组织大量增殖；所述的分蘖芽为茎节拉长的分蘖芽；所述的诱导培养基为：每升含有2,4‑二氯苯氧乙酸1.0～10.0毫克、噻重氮苯基脲0.1～1.0毫克、磷酸二氢钠150～200毫克、蔗糖30克、琼脂6～7克，其余为1/2MS培养基，pH 5.8～6.0；所述的增殖培养基为：每升含有2,4‑二氯苯氧乙酸1.0～10.0毫克、噻重氮苯基脲0.1～1.0毫克、磷酸二氢钠150～200毫克、椰子汁100～200毫升、蛋白胨1～2克、蔗糖30克、琼脂6～7克，其余为1/2MS培养基，pH 5.8～6.0；b、类原球茎的诱导和增殖：将愈伤组织转移到类原球茎的诱导和增殖培养基上培养，培养温度24℃～30℃，光照度1500～2000勒克斯，光照时间12～16小时/天，获得类原球茎，然后将类原球茎接种到新的类原球茎的诱导和增殖培养基上进行增殖培养，培养温度24℃～30℃，光照度1500～2000勒克斯，光照时间12～16小时/天，类原球茎大量增殖；所述的类原球茎的诱导和增殖培养基为：每升含有噻重氮苯基脲0.1～0.5毫克、激动素1.0～5.0毫克、磷酸二氢钠150～200毫克、椰子汁100～200毫升、蛋白胨1～2克、蔗糖30克、琼脂6～7克，其余为1/2MS培养基，pH 5.8～6.0；c、类原球茎的分化：将类原球茎接种到分化培养基上培养，培养温度24℃～30℃，光照度1500～2000勒克斯，光照时间12～16小时/天，类原球茎分化出不定芽，所述的分化培养基为：每升含有萘乙酸1.0～2.0毫克、磷酸二氢钠150～200毫克、椰子汁100～200毫升、蛋白胨1～2克、活性炭1.0～2.0克、蔗糖30克、琼脂6～7克，其余为1/2MS培养基，pH 5.8～6.0；d、生根壮苗培养：将不定芽切成单芽后转到生根壮苗培养基上培养，培养温度24℃～30℃，光照度1500～2000勒克斯，光照时间12～16小时/天，获得完整植株，所述的生根壮苗培养基为：每升含有萘乙酸1.0～2.0毫克、磷酸二氢钠150～200毫克、椰子汁100～200毫升、蛋白胨1～2克、香蕉匀浆50～150克、活性炭1.0～2.0克、蔗糖15～30克、琼脂6～7克，其余为1/2MS培养基，pH 5.8‑6.0；e、试管苗移栽：将完整植株在自然光下炼苗10～15天，然后取出植株洗净根部的培养基，移栽到植金石、松树皮和泥炭土按质量比2～3:2～3:1混合的栽培基质中培养获得海伦兜兰种苗；所述的茎节拉长的分蘖芽是通过以下方法获得的：选择刚冒出分蘖芽的植株生长势强的海伦兜兰(Paphiopedilum helenae Aver.)为母株，对叶面喷施35％尅土菌可湿性粉剂的500～800倍稀释水溶液并用其浇透基质，稍干后放入光照人工气候箱中进行暗/光交替培养，培养温度25℃～30℃，湿度75％～90％，光照度2000～3000勒克斯；培养过程中每3天浇一次水，每15天对叶面喷施35％尅土菌可湿性粉剂的500～700倍稀释水溶液或72％农用链霉素可溶性粉剂的3000～4000倍稀释水溶液一次，35％尅土菌可湿性粉剂的500～700倍稀释水溶液和72％农用链霉素可溶性粉剂的3000～4000倍稀释水溶液交替使用，获得3～4厘米长，具有3～4个节的分蘖芽，得到茎节拉长的分蘖芽。