[发明专利]一种利用CRISPR‑Cas9清除鲍曼不动杆菌耐药性基因的方法在审
| 申请号： | 201610978586.8 | 申请日： | 2016-11-08 |
| 公开（公告）号： | CN106544353A | 公开（公告）日： | 2017-03-29 |
| 发明（设计）人： | 魏军;刘晓明;乔霞;贾伟;李刚 | 申请（专利权）人： | 宁夏医科大学总医院 |
| 主分类号： | C12N15/74 | 分类号： | C12N15/74;C12R1/01 |
| 代理公司： | 银川长征知识产权代理事务所64102 | 代理人： | 陈晓庆 |
| 地址： | 750001 宁夏回*** | 国省代码： | 宁夏;64 |
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| 摘要： | 本发明公开一种利用CRISPR‑Cas9清除鲍曼不动杆菌耐药性基因的方法，该方法是先从临床收集鲍曼不动杆菌，采用药敏纸片法对鲍曼不动杆菌进行耐药测定处理后，进行耐药分析及统计；将多重耐药的鲍曼不动杆菌，用裂解煮沸法将其进行DNA的提取，然后利用其设计好的耐药基因引物进行扩增分析；根据上一步耐药基因的检测，挑选出含有OXA‑23基因的鲍曼不动杆菌，构建CRISPR/Cas9和sgRNA的质粒，将其导入到含有OXA‑23基因的鲍曼不动杆菌中，构建OXA‑23基因缺失鲍曼不动杆菌突变菌株，对其进行耐药性分析。该方法操作简单、敲除效率高，为阻止耐药基因的传播和治疗耐药细菌提供新的方法和思路。 | ||
| 搜索关键词： | 一种 利用 crispr cas9 清除 不动 杆菌 耐药性 基因 方法 | ||
【主权项】：
一种利用CRISPR‑Cas9清除鲍曼不动杆菌耐药性基因的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：S1：临床鲍曼不动杆菌的耐药分析：从临床收集鲍曼不动杆菌，采用药敏纸片法对鲍曼不动杆菌进行耐药测定处理，24h后记录结果，并进行耐药分析及统计；S2：鲍曼不动杆菌耐药基因型的检测：将多重耐药的鲍曼不动杆菌，用裂解煮沸法将其进行DNA的提取，然后利用其设计好的耐药基因引物进行扩增分析；S3：CRISPR/Cas9介导对含有OXA‑23基因的鲍曼不动杆菌的逆转作用：根据步骤S2中耐药基因的检测，挑选出含有OXA‑23基因的鲍曼不动杆菌；S4：构建细菌特有CRISPR/Cas9的表达质粒；S5：构建sgRNA1质粒、sgRNA2质粒和sgRNA3质粒的序列，具体为：sgRNA1:ctagttvvatttagtgaaaaagtgcaggsgRNA2:ctagtatattaatgaaatatttaaatggsgRNA3:ctagtctacaaaatttttggaaagactgg；S6：将CRISPR/Cas9和所述sgRNA1质粒、sgRNA2质粒和sgRNA3质粒导入到含有OXA‑23基因的鲍曼不动杆菌中，构建OXA‑23基因缺失鲍曼不动杆菌突变菌株△OXA‑23，对△OXA‑23进行耐药性分析。
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