[发明专利]一种小麦γ-醇溶蛋白启动子区域甲基化的检测方法

摘要

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种针对小麦γ‑醇溶蛋白启动子区域是否被甲基化的检测方法。所述小麦γ‑醇溶蛋白为γ‑醇溶蛋白TaWG04，所述启动子为启动γ‑醇溶蛋白TaWG04进行翻译表达的启动子pTaWG04。pTaWG04启动子的‑749bp处胞嘧啶和‑729bp处胞嘧啶发生甲基化修饰时，抑制γ‑醇溶蛋白TaWG04的表达。本申请所提供的甲基化检测方法特异性针对小麦γ‑醇溶蛋白启动子区域进行检测，具有检测周期短、特异性高、准确度高等优点；可对启动子是否存在甲基化进行判定，进而可有效识别γ‑醇溶蛋白TaWG04在小麦品种中的表达情况，从而为小麦品质改良奠定理论依据和应用基础。

主权项

1.一种小麦γ‑醇溶蛋白启动子区域甲基化的检测方法，其特征在于，所述小麦γ‑醇溶蛋白为γ‑醇溶蛋白TaWG04，所述启动子为启动γ‑醇溶蛋白TaWG04进行转录表达的启动子pTaWG04，pTaWG04启动子的碱基序列如SEQ ID NO.1所示；具体检测步骤如下：（1）提取小麦样品的DNA，并用重亚硫酸盐处理DNA提取物；（2）设计特异性引物序列如下：正向引物F：5’‑ATTTTTTGAGGAATTTTATATTTGGTT‑3’，反向引物R：5’‑ATCCGTTTCAATTAAATCTTCCA‑3’；（3）以步骤（1）中处理后DNA为模板，利用步骤（2）中所设计的引物序列，进行甲基化特异PCR反应；（4）回收步骤（3）中PCR扩增产物，利用TA克隆技术，将所回收的PCR扩增片段克隆到pMD18‑T载体上，经转化、筛选、验证后，挑选阳性克隆质粒进行测序；将测序结果与确定的未甲基化序列进行比对，最终判定启动子pTaWG04区域碱基序列的甲基化情况，判定方法为：经甲基化特异PCR反应后，DNA序列中非甲基化的胞嘧啶会完全转化为尿嘧啶，而如果含有甲基化碱基，则甲基化的5‑甲基胞嘧啶会保持不变；所述确定的未甲基化序列为小麦品种中γ‑醇溶蛋白TaWG04正常表达所对应的的启动子pTaWG04的序列。