[发明专利]一种高效液相色谱串联质谱法检测蚯蚓体内CYP2C9酶活力的方法

摘要

本发明涉及一种高效液相色谱串联质谱法检测蚯蚓体内CYP2C9酶活力的方法，属于酶活力检测技术领域，该方法具体包括如下步骤：(1)制备蚯蚓微粒体蛋白悬浮液；(2)将步骤(1)中制得的蚯蚓微粒体蛋白悬浮液加入含有探针底物的孵育体系中，升温启动酶促反应，待酶促反应终止后，利用高效液相色谱串联质谱联用仪检测经酶促反应终止后所产生的代谢产物，计算CYP2C9酶活力。该检测方法准确度、精确度及灵敏度高，稳定性强，可用于不同污染环境下蚯蚓体内CYP2C9活力的分析检测，进而为探索CYP2C9作为生物标记物指示土壤污染的可能性提供了检测方法。

主权项

1.一种高效液相色谱串联质谱法检测蚯蚓体内CYP2C9酶活力的方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）制备蚯蚓微粒体蛋白悬浮液；（2）将步骤（1）中制得的蚯蚓微粒体蛋白悬浮液加入含有探针底物的孵育体系中至所述微粒体蛋白浓度为10‑100 μg/ml，所述探针底物的浓度为100 μM，升温启动酶促反应，待酶促反应终止后，利用高效液相色谱串联质谱联用仪检测经酶促反应终止后所产生的代谢产物，计算CYP2C9酶活力；所述探针底物为双氯芬酸钠；所述代谢产物为4¢‑羟基双氯芬酸；高效液相色谱条件为：a）色谱柱：MS Luna C18柱，2.1 mm × 50 mm，3.0 mm，并配备相应的C18保护柱；b）流动相由A相和B相组成，所述A相为水或含体积分数为0.1%甲酸的水的一种，所述B相为乙腈或含体积分数为0.1%甲酸的乙腈的一种；c）梯度洗脱条件：0‑4 min，流动相B的比例由5%上升至95%；4‑8 min，流动相B的比例由95%下降至5%；8‑10 min，流动相B的比例为5%；d）柱温：50℃；e）流速：0.2 ml/min；f）自动进样室温度： 4℃，进样体积为5 μl；质谱条件为：a）离子源：电喷雾电离；b）检测方式：正离子；c）电喷雾电压：3 kV ；d）离子源温度：350℃；e）碰撞气体及气压：氩气，1.2 mTorr；f）扫描模式：多反应离子监测；g）氮鞘、离子扫描、辅助气体：分别设置为40、0、10个单位。