[发明专利]提高S－腺苷蛋氨酸和谷胱甘肽发酵产量的方法

摘要

本发明涉及一种提高S－腺苷蛋氨酸和谷胱甘肽发酵产量的方法，包括以下步骤：将外源性的表达ATP6基因的片段导入酵母菌株中，得到重组酵母菌株，将重组酵母菌株进行发酵培养后得到S－腺苷蛋氨酸和谷胱甘肽。本发明采用重组DNA技术，将ATP6基因整合至产朊假丝酵母(Candida utilis CCTCC M 209298)基因组中，提高了线粒体中ATP合成酶的活性，促进ATP再生，为胞内SAM和GSH的生物合成提供充足的ATP，并最终实现SAM和GSH联合高产。

主权项

1.一种提高S‑腺苷蛋氨酸和谷胱甘肽发酵产量的方法，其特征在于，包括以下步骤：将外源性的表达ATP6基因的片段导入酵母菌株中，得到重组酵母菌株，将所述重组酵母菌株进行发酵培养后得到S‑腺苷蛋氨酸和谷胱甘肽；所述酵母菌株为产朊假丝酵母Candida utilis CCTCC M 209298；所述重组酵母菌株的构建包括以下步骤：(1)以所述酵母菌株的基因组为模板，利用GAP启动子的上游引物和GAP启动子的下游引物扩增出所述酵母菌株的启动子序列，所述启动子序列如SEQ ID No.1所示；其中，所述GAP启动子的上游引物的核苷酸序列为：GGATCCAAGCTTACAGCGAGCACTCA；所述GAP启动子的下游引物的核苷酸序列为：CCATGGTGAGTGCTCGCTGTAAGCTT；(2)将步骤(1)得到的所述启动子序列与ATP6基因片段在所述启动子的上游引物和ATP6基因下游引物序列的作用下进行PCR扩增，得到ATP6基因表达组件；其中，所述ATP6基因片段序列如SEQ ID No.2所示；所述ATP6基因表达组件序列如SEQ ID No.3所示；所述ATP6基因下游引物序列为：TCACCTTCTGTGTTGCTGGA；(3)以所述酵母菌株的基因组为模板，利用插入位点序列的上游引物和插入位点序列的下游引物扩增出插入位点序列，所述插入位点序列如SEQ ID No.4所示；其中，所述插入位点序列的上游引物的核苷酸序列为：GCGGCCGCGATCCTGCCAGTAGTCATAT；所述插入位点的序列下游引物的核苷酸序列为：GGATCCTGTACAAAGGGCAGGGACGT；(4)将步骤(2)得到的所述ATP6基因表达组件序列、步骤(3)得到的所述插入位点序列以及放线菌酮抗性基因mL41分别连接到质粒中，得到质粒pPICZalpha A‑kan，然后用限制性内切酶E.coR 1线性化后电转入酵母菌株的感受态细胞中，培养后筛选出阳性单克隆，得到所述重组酵母菌株；其中，所述放线菌酮抗性基因mL41的序列如SEQ ID No.5所示；所述质粒pPICZalpha A‑kan的序列如SEQ ID No.6所示。