[发明专利]一种心肌细胞分离方法

摘要

本发明公开了一种心肌细胞分离方法，包括以下步骤：将新鲜离体的心脏放入4℃预冷的保护液中，剪取心室肌组织，并用冲洗液洗净，再剪成小块；接着依次进行胰蛋白酶消化、高浓度缓冲液浸泡、消化液消化、低浓度缓冲液浸泡；将高浓度缓冲液浸泡液、消化后的上清液和低浓度缓冲液浸泡后混合物混合均匀，并用吸管吹打，然后过滤掉心肌组织沉淀物，收集滤液并离心，得到分离后的心肌细胞沉淀。本发明的方法利用钾离子浓度下降对心肌细胞产生的刺激，提高心肌细胞的活性，避免长时间的消化引起的心肌细胞形态发生变化、细胞存活率降低的问题。

主权项

一种心肌细胞分离方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1，将新鲜离体的心脏放入4℃预冷的保护液中，剪取心室肌组织，并用冲洗液洗净，再将心室肌组织剪成1mm×1mm×1mm的小块，然后于冲洗液中浸泡3‑5min，过滤，得到心肌组织样品，备用；每升所述保护液含有以下组分：8g的NaCl、0.4g的KCl、0.06g的Na2HPO4·H2O、0.06g的KH2PO4、0.35g的NaHCO3，溶剂为双蒸水；每升冲洗液中含有以下组分：9g的NaCl、0.3g的KCl，溶剂为双蒸水；步骤2，将心肌组织样品置于1g/L的胰蛋白酶溶液中，37℃消化5‑8min，弃去上清液，得到第一次沉淀物；步骤3，将第一次沉淀物置于高浓度缓冲液中浸泡3‑5min，过滤，收集第二次上清液和第二次沉淀物；每升高浓度缓冲液中含有以下组分：8.5g的NaCl、0.25g的KCl，溶剂为双蒸水；步骤4，将第二次沉淀物置于消化液中，然后用NaOH调节pH至7‑7.5，37℃消化5‑8min，过滤，收集第三次上清液和第三次沉淀物；步骤5，将第三次沉淀物置于低浓度缓冲液中浸泡3‑5min，得到细胞混合物；每升低浓度缓冲液中含有以下组分：6g的NaCl、0.2g的KCl，2‑4mg的L‑谷氨酸、2‑4mg的甘氨酸、1‑2g的葡萄糖，溶剂为双蒸水；步骤6，将第二次上清液、第三次上清液和细胞混合物混合均匀，并用吸管吹打，然后过滤掉心肌组织沉淀物，收集滤液并离心，得到分离后的心肌细胞沉淀。