[发明专利]不饱和透明质酸奇数寡糖的制备方法

摘要

本发明公开了一种不饱和透明质酸奇数寡糖的制备方法，主要选用微生物透明质酸酶酶解透明质酸，再经低压层析色谱柱分离纯化，最后用体积排阻色谱法脱盐，即得一系列不饱和透明质酸奇数寡糖，其分子式为C6+14nH8+21nO6+11nNn，分子量为176.0320+(379.1146)n道尔顿，聚合度为2n+1，5≥n≥1。本发明的制备方法不仅操作简便、耗时较短，而且得糖率高，纯度达到百分之百，克服了现有合成和降解技术难以快速制备一系列不饱和透明质酸奇数寡糖的困难。本发明制得的不饱和透明质酸奇数寡糖为进一步研究低聚合度透明质酸的构效关系，以及指导其未来在临床、食品和化妆品等领域的应用提供了重要的价值。

主权项

1.一种不饱和透明质酸奇数寡糖的制备方法，所述不饱和透明质酸奇数寡糖的分子式为C_6+14nH_8+21nO_6+11nN_n，分子量为176.0320+(379.1146)n道尔顿，聚合度(dp)为2n+1，其结构式为：其中，5≥n≥1；所述制备方法主要将透明质酸经过酶解、分离纯化和脱盐三个步骤制得一系列不饱和透明质酸奇数寡糖，其特征在于，包括如下具体步骤：步骤1)将冻干粉末状透明质酸用纯水配成浓度为8‑10mg/mL的透明质酸溶液，将冻干粉末状微生物透明质酸酶用酶解工作液配成150‑200IU/mL的透明质酸酶溶液；所述微生物透明质酸酶来源于Streptomyces hyalurolyticus；步骤2)取所述透明质酸溶液5‑8份，在冰浴条件下加入所述透明质酸酶溶液1‑2份，震荡混匀，在35‑40℃水浴箱中孵育24‑36h，制成样品；将所述样品移至95‑100℃水浴锅中，加热5‑7min，离心，去沉淀；步骤3)利用低压层析色谱柱对去沉淀后的所述样品进行分离纯化，其中所述低压色谱柱的填料为Bio‑gel P4、Bio‑gel P6或Bio‑gel P10，流动相浓度为0.1‑0.2M，流速0.1‑0.2mL/min，平衡后上样1mL，示差检测器检测，馏分收集器10‑12min/管收集，合并收集，再通过旋转蒸发仪进行浓缩，获得一系列不饱和透明质酸奇数寡糖粗品；步骤4)将获得的不饱和透明质酸奇数寡糖粗品利用体积排阻色谱柱分别进行除盐，所述体积排阻色谱柱的填料为Sephadex G25或Sephadex G50，纯水为流动相，流速0.1‑0.2mL/min，平衡后上样1mL，示差检测器检测，馏分收集器10‑12min/管收集，浓缩，冻干，即制得一系列不饱和透明质酸奇数寡糖纯品。