[发明专利]一种从凝结芽孢杆菌补料分批发酵液中提取蛋白质的方法

摘要

本发明公开了一种从凝结芽孢杆菌补料分批发酵液中提取蛋白质的方法，依次包括补料分批发酵、低温离心、硫酸铵分级沉淀、低温离心、取沉淀溶解，再进行透析、冷冻干燥。本发明从凝结芽孢杆菌发酵液中提取蛋白质的方法，建立了一种简单的操作流程，得到不同分子量的蛋白质和多肽。通过对提取出的蛋白质进行抑菌作用测定，发现部分组分蛋白质具有一定的抑制病原菌作用。此方法不仅工艺简单、提取率高，而且提高了不同分子量蛋白质的得率，为新型微生态制剂的生产提供模板。

主权项

一种从凝结芽孢杆菌补料分批发酵液中提取蛋白质的方法，其具体步骤如下：(1)补料分批发酵：将凝结芽孢杆菌菌株接种在营养琼脂培养基后培养，选取一个单菌落，挑取菌体，接入装有种子液培养基的锥形瓶中，锥形瓶装液量为锥形瓶体积的18～22％，温度控制在35～42℃，摇床转速140～200r/min，培养32～48h后，得到种子液；再移取发酵培养基体积分数比为4～8％的种子液接入发酵罐中发酵培养，其中发酵罐装液量为发酵罐体积的25～45％，控制温度在36～42℃，通入无菌空气，通气量保持在3～6L/(L·min)，搅拌速率140～200r/min，pH值为6.5～7.5，采用流加葡萄糖的方法进行补料分批发酵，使发酵过程中葡萄糖浓度保持在80～100g/L，培养32～48h后即为发酵液；(2)低温离心：将步骤(1)中的发酵液装入离心管中，置于3～9℃低温离心机中离心得到上清液和沉淀，取上清液；(3)硫酸铵分级沉淀：将步骤(2)中的得到的上清液置于搅拌仪上，在20～24℃温度下加入固体硫酸铵，使其饱和度达相应温度下的20～26％，磁力充分搅拌3～4h后，低温离心收集第一级沉淀物和第一级上清液；将得到的第一级上清液转入烧杯中，并以硫酸铵饱和度15～21％为梯度，继续加入固体硫酸铵充分搅拌，即离心收集到蛋白组分的第二级沉淀物；重复上述步骤，收集第三级沉淀物；(4)透析：将步骤(3)中得到的第一、二和三级沉淀物装好并悬于含20～30％体积分数Tris碱的蒸馏水中，使悬液中沉淀物的浓度达到5～15mg/mL；将悬液移至透析袋中，排出空气并密封，透析袋中悬液的装液量为透析袋体积的35～45％，在温度为5～10℃条件下，用蒸馏水透析6～10h，期间换液2～4次；再转至缓冲液中，相同温度条件下继续透析28～32h，得蛋白提取液；将提取液冷冻干燥即得到蛋白质。